肺癌（Lung Cancer）是世界上最常見(jiàn)的癌癥。也是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因。從病理和治療角度，肺癌大致可以分為非小細(xì)胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) 和小細(xì)胞肺癌( small cell lung cancer，SCLC) 兩大類(lèi)。占全部肺癌病例總數(shù)約85%的非小細(xì)胞肺癌，包括腺癌、鱗癌等組織學(xué)亞型。而肺腺癌（LUAD）是其中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，占所有病例的40%。因此，針對(duì)肺腺癌（LUAD）發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究探索，以及進(jìn)行新興免疫療法等的深入挖掘，對(duì)于改善多數(shù)肺癌患者的生存期并提高其生活質(zhì)量至關(guān)重要。

肺癌的分類(lèi)及主要起源細(xì)胞

構(gòu)建模擬體內(nèi)真實(shí)肺腺癌發(fā)生發(fā)展的疾病模型是研究肺腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制重要基礎(chǔ)。2022年9月，來(lái)自美國(guó)麻省理工學(xué)院的Santiago Naranjo團(tuán)隊(duì)，發(fā)表在Genes&Development題為Modeling diverse genetic subtypes of lung adenocarcinoma with a next-generation alveolar type 2 organoid platform的研究描述了一種基于肺腺癌（LUAD）發(fā)生的主要起源細(xì)胞——肺泡二型上皮細(xì)胞（AT2）構(gòu)建的正常肺泡類(lèi)器官通過(guò)基因編輯來(lái)實(shí)現(xiàn)模擬肺腺癌的不同基因分型腫瘤發(fā)生的疾病模型，并實(shí)現(xiàn)了首個(gè)具有免疫功能正常宿主的基于類(lèi)器官的LUAD移植模型的建立，為肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療提供了高效、便捷的研究模型。

為了建立基于類(lèi)器官的肺腺癌發(fā)生模型，作者將來(lái)自轉(zhuǎn)基因Sftpc-eGFP小鼠的新鮮解離的大量肺細(xì)胞懸液嵌入到Matrigel液滴中并覆蓋F7NHCSA（FGF7，NOGGIN，HGF，CHIR99021，SB202190和A-83-01）培養(yǎng)基。Sftpc-eGFP轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記表達(dá)典型AT2標(biāo)記基因Sftpc的細(xì)胞。且在每次傳代時(shí)，作者對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行充分解離后進(jìn)行流式分選以確定eGFP+的細(xì)胞比例。最初，作者觀察到eGFP+細(xì)胞的強(qiáng)勁擴(kuò)增，表明AT2狀態(tài)的維持。然而，但隨著代次的更迭，eGFP+細(xì)胞占總體細(xì)胞的比例不斷降低，eGFP-細(xì)胞比例不斷升高?；蚣患治觯℅SEA）表明，此培養(yǎng)系統(tǒng)中的eGFP+和eGFP?細(xì)胞可能分別代表AT2和Basal細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析，作者確定MHCII作為eGFP+-AT2的表面標(biāo)記和EGFR作為eGFP?Basal的表面標(biāo)記。通過(guò)定量?jī)煞N表面蛋白的表達(dá)，不僅可使得在此系統(tǒng)中快速和定量評(píng)估AT2細(xì)胞狀態(tài)保真度，還可以應(yīng)用于在無(wú)Sftpc報(bào)告基因的情況下的AT2類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的鑒定。此外，作者還開(kāi)發(fā)了一種優(yōu)化方案能夠穩(wěn)健地?cái)U(kuò)增AT2細(xì)胞，獲得可長(zhǎng)期穩(wěn)定維持的肺泡類(lèi)器官（圖1）。

圖1. 優(yōu)化后培養(yǎng)方法使得AT2類(lèi)器官實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期擴(kuò)增

與維持 AT2 狀態(tài)一致，免疫組織化學(xué)染色顯示，這些類(lèi)器官表達(dá) SFTPC，但缺乏其他主要肺上皮細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)志物的表達(dá)。同時(shí)，組成這些類(lèi)器官的細(xì)胞密集地堆積著一種在原代AT2細(xì)胞中儲(chǔ)存和分泌肺表面活性劑的層狀體特殊結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2. AT2類(lèi)器官保留了體內(nèi)對(duì)應(yīng)物的關(guān)鍵表型

接下來(lái)，作者測(cè)試了這些類(lèi)器官分化成肺泡1型細(xì)胞（AT1）狀態(tài)的能力。作者比較了在正常（F7NHCS 3D）培養(yǎng)條件與2D培養(yǎng)環(huán)境下完整培養(yǎng)基（F7NHCS 2D）或分化培養(yǎng)基（10% FBS 2D）分別分化為AT1狀態(tài)的能力。并進(jìn)行了染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序（sci-ATAC-seq），最終得出結(jié)論：2D培養(yǎng)環(huán)境促進(jìn)其部分分化為AT1狀態(tài)，而F7NHCS培養(yǎng)基促進(jìn)AT2特征的保留，此外，補(bǔ)充10%FBS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化為更完全的AT1狀態(tài)。

緊接著，作者利用上述優(yōu)化后的AT2類(lèi)器官模型來(lái)模擬臨床相關(guān)的LUAD亞型。作者選用了TP53缺失型（P only）、KRAS突變及TP53缺失型（KP）、Eml4-Alk融合突變及TP53缺失型(EAP)以及Braf突變及TP53缺失型（BP）進(jìn)行疾病建模。并進(jìn)行了類(lèi)器官致癌轉(zhuǎn)化效率測(cè)試及致瘤潛力測(cè)試，將它們?cè)灰浦驳酵吹拿庖咴孕∈笾校琄P、EAP和BP類(lèi)器官在100%的受體小鼠中引起宏觀腫瘤，并產(chǎn)生廣泛的腫瘤負(fù)荷。這些腫瘤不僅均涵蓋了腫瘤進(jìn)展的全譜，包括增生（1級(jí)）、腺瘤（2級(jí)）、腺癌（3級(jí)）和浸潤(rùn)性腺癌（4級(jí)）。Nkx2.1和Hmga2腫瘤進(jìn)展階段的典型標(biāo)志物等數(shù)據(jù)表明，此疾病模型概括了不同遺傳亞型LUAD在疾病進(jìn)展的多個(gè)階段中的基本組織病理學(xué)和分子特征。??

最后，作者進(jìn)一步開(kāi)發(fā)LUAD的免疫原性原位類(lèi)器官移植模型。作者用含有熒光報(bào)告基因mScarlet的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化的KP類(lèi)器官，與來(lái)自雞卵清蛋白（OVA257-264）的MHCI類(lèi)限制性肽抗原融合，生成KP-mScarlet-SIINFEKL（KP-SIIN）類(lèi)器官。隨后將KP-SIIN類(lèi)器官移植到博來(lái)霉素預(yù)處理的免疫功能正常的同系受體中。此外，作者通過(guò)定量測(cè)定肺浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞中抗原特異性細(xì)胞的比例，這現(xiàn)了腫瘤發(fā)生過(guò)程中隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)的免疫功能障礙的現(xiàn)象。總之，這些結(jié)果證實(shí)了這種類(lèi)器官移植模型用于研究腫瘤-免疫相互作用和LUAD中潛在的T細(xì)胞功能障礙的巨大潛力（圖3）。

圖3. 追蹤來(lái)自移植抗原表達(dá)的類(lèi)器官在腫瘤中的腫瘤免疫相互作用

▍以上內(nèi)容來(lái)自伯楨生物編輯部

撰文：王十一

編輯：李嘉欣