發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology

影響因子：5.81

合作單位：重慶醫(yī)科大學(xué)

百趣生物提供服務(wù)：中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)

1研究背景

慢性腎功能衰竭（CRF）是一種由多種原因?qū)е履I功能進(jìn)行性喪失并最終導(dǎo)致腎功能衰竭的疾病。近年來，CRF因其病情危重、發(fā)病率和死亡率高，已成為不可忽視的重大公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)CRF的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳因素、血液動力學(xué)變化、炎癥因子、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)。CRF的主要治療方法是腎移植和血液透析，但療效較差。

復(fù)腎湯（FSGD）是國醫(yī)大師郭子光教授經(jīng)60余年的臨床創(chuàng)制的經(jīng)驗(yàn)方。其作用是補(bǔ)腎、活血、化濁，改善腎功能和腎纖維化。本文作者課題組先前的研究表明FSGD可以顯著降低α-SMA和TGF-β1的表達(dá)水平，從而減少腎纖維化。盡管FSGD在CRF中的臨床應(yīng)用已經(jīng)得到驗(yàn)證，但由于其成分和靶點(diǎn)的復(fù)雜性，其治療CRF的機(jī)制尚不清楚。

重慶醫(yī)科大學(xué)黃學(xué)寬課題組羅洪玉在相關(guān)研究中，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和UHPLC-MS/MS技術(shù)，對FSGD治療CRF的有效成分及其作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學(xué)信號通路是FSGD治療GRF的關(guān)鍵通路。

圖1. FSGD在GRF中的研究示意圖

2研究設(shè)計(jì)

將雄性SD大鼠(200±20g)隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組（NDQ）、FSGD組。用腺嘌呤建立CRF動物模型，然后FSGD治療4周。收集血清和尿液樣本，檢測代謝生化指標(biāo)以評估腎功能。通過對腎臟組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和馬松染色實(shí)驗(yàn)來評價(jià)腎臟病理損傷程度。采用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡分析檢測蛋白的表達(dá)水平。

3研究結(jié)果

（1）FSGD的藥用活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到121個FSGD藥用成分。以O(shè)B≥30%、HL≥4和DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的藥用成分進(jìn)行進(jìn)一步分析，在FSGD中預(yù)測得到893個假定靶點(diǎn)。

（2）CRF靶點(diǎn)預(yù)測和共有靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中總共獲得8596個CRF 靶點(diǎn)。其中1115個靶點(diǎn)可以作為候選治療靶點(diǎn)。將 FSGD 的靶點(diǎn)與 CRF 的靶點(diǎn)進(jìn)行比對并繪制維恩圖，發(fā)現(xiàn)192 個共有靶點(diǎn)，例如 EGFR、TNF和AKT1(圖2A)。第一維共同靶點(diǎn)被認(rèn)為是FSGD 抗CRF的潛在治療靶點(diǎn)。

（3）GO和KEGG富集分析

經(jīng)GO分析，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)參與了CRF的過程(圖2B)。在KEGG通路富集化分析位于前15的信號通路中，PTEN/PI3K/AKT/NF-κB參與慢性腎功能衰竭過程中細(xì)胞的凋亡與增殖、炎癥和纖維化(圖2C)。先前研究表明，F(xiàn)SGD可通過RAS系統(tǒng)中的ACE-Ang II-AT1R軸改善CRF大鼠的腎功能，抑制腎纖維化，而RAS與肝臟中的PI3K/AKT通路密切相關(guān)。據(jù)此，作者推測FSGD治療CRF的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信號通路。

（4）FSGD治療GRF理論活性成分一維網(wǎng)絡(luò)可視化

利用192個共有靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明STAT3,PIK3CA,PIK3R1,MAPK1,SRC和AKT1是PPI網(wǎng)絡(luò)中前六大靶基因。其中PIK3CA,PIK3R1和AKT1與PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路有關(guān)，AKT1是關(guān)鍵基因(圖2D-E)

圖2. FSGD在GRF中的第一維網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

（5）UHPLC-MS/MS檢出有效成分的第二維網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

FSGD正/負(fù)總離子流圖展示了該湯劑所有化合物的化學(xué)成分，經(jīng)過與中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫收集的有效化合物比對出40種化合物。使用前面的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出9個候選化合物，并預(yù)測了它們的靶標(biāo)(圖3A-C)，然后進(jìn)行了第二維網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。PPI結(jié)果表明，AKT1是該網(wǎng)絡(luò)的最高靶基因和中心基因。此外，GO、KEGG和PPI的結(jié)果都參與了PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學(xué)通路(圖4A-D)。

圖3. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)鑒定FSGD水提取物溶液中的化學(xué)成分

圖4. CRF中FSGD檢測成分的第二維網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

（6）FSGD對腎功能的保護(hù)作用

通過24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮檢測腎功能。與正常組相比，模型組大鼠24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮均顯著升高，表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了CRF大鼠模型。然而，F(xiàn)SGD和NDQ顯著降低了這些CRF指標(biāo)，且FSGD組改善顯著(圖5A-C)。結(jié)果表明，F(xiàn)SGD可以改善CRF癥狀和腎功能。

圖5. FSGD對腎病理性損傷和腎纖維化的影響

（7）FSGD減輕腎臟病理損傷和腎纖維化

與正常組相比，模型組大鼠腎臟病理形態(tài)發(fā)生顯著改變，腎小管擴(kuò)張或萎縮，大量炎性細(xì)胞浸潤，腺嘌呤結(jié)晶沉積阻塞管腔。同時，NDQ和FSGD可減輕上述病理損傷。經(jīng)Masson染色，與對照組相比，模型組大鼠腎組織中膠原纖維顯著累積，F(xiàn)SGD顯著改善腎纖維化(圖5D-E)。

（8）FSGD對慢性腎衰模型PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組PTEN表達(dá)顯著降低，而FSGD組PTEN表達(dá)顯著升高(圖6A-B)，表明PTEN表達(dá)主要受PI3K/AKT通路調(diào)控。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，模型組腎組織中PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)均顯著升高，F(xiàn)SGD和NDQ顯著上調(diào)PTEN的表達(dá)，提示降低PI3K、AKT和p-AKT的表達(dá)是通過抑制 PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的(圖6C-E)。

為了驗(yàn)證上述假設(shè)，作者使用蛋白印跡分析進(jìn)一步檢測了腎臟中的關(guān)鍵因子PTEN及其上游因子PI3K和p-PI3K的蛋白水平。與正常組比較，模型組大鼠PTEN表達(dá)顯著降低，F(xiàn)SGD和NDQ治療后PTEN表達(dá)顯著增加(圖7A-D)。此外，在模型組PI3K和p-PI3K的表達(dá)顯著增加，而FSGD和NDQ處理組與模型組相比，PI3K和p-PI3K的表達(dá)顯著降低(圖7A-D)。

為了進(jìn)一步揭示FSGD在PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路中的作用機(jī)制，作者測定了下游因子AKT、p-AKT和NF-κB，因?yàn)檫@些因子在腎纖維化中起著重要作用。與正常組相比，模型組腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達(dá)顯著增加，表明腎組織中PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學(xué)通路被激活，而FSGD和NDQ處理后腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達(dá)顯著降低(圖7E-H)，說明FSGD和NDQ處理能夠抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學(xué)通路。

圖6. FSGD對PI3K/AKT通路的影響

圖7. PI3K/AKT通路蛋白分析

圖8. FSGD治療CRF分子調(diào)控示意圖

4總結(jié)

綜上所述，作者本研究中進(jìn)行系統(tǒng)地鑒定了FSGD中包含的成分，并通過二維網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了FSGD治療CRF的分子調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)SGD減輕CRF大鼠腎纖維化和腎損傷的作用可能與抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學(xué)信號通路有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是探索復(fù)雜疾病機(jī)制和藥物多靶點(diǎn)的新策略，可以幫助中藥研究人員更準(zhǔn)確地找到最可能的藥物治療機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供更充分的理論基礎(chǔ)。

文/阿趣代謝組學(xué)