? ? ? ?今天是反義RNA病毒最后一站——仙臺(tái)病毒(Sendai Virus)。

簡(jiǎn)介

? ? ? ? 鼠呼吸道病毒(Murine Respirovirus)，以前稱為仙臺(tái)病毒(SeV)、鼠副流感病毒1型或日本血凝病毒 (HVJ)，是一種有包膜、直徑為150-200nm、反義的單鏈RNA病毒。它通常感染嚙齒動(dòng)物，對(duì)人類或家畜沒(méi)有致病性。仙臺(tái)病毒 (SeV) 是呼吸道病毒家族(Respirovirus)的成員。該病毒于1950年代初在日本仙臺(tái)市被分離出來(lái)。 從那時(shí)起，它作為模型病原體被積極用于研究。 該病毒對(duì)許多癌細(xì)胞系具有傳染性，在動(dòng)物模型和動(dòng)物自然發(fā)生的癌癥中具有溶瘤特性。SeV融合真核細(xì)胞和形成合胞體的能力被用來(lái)生產(chǎn)能夠大量制造單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 基于SeV的載體的最新應(yīng)用包括將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和疫苗生產(chǎn)。 出于疫苗接種目的，基于仙臺(tái)病毒的構(gòu)建體可以以滴鼻劑的形式遞送，這可能有益于誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)。SeV有幾個(gè)特征對(duì)于成功疫苗的載體很重要：病毒不會(huì)整合到宿主基因組中，不會(huì)進(jìn)行基因重組，它只在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，沒(méi)有DNA中間體，并且不會(huì)引起人類或家畜的任何疾病。 仙臺(tái)病毒被用作開發(fā)針對(duì)引起結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌、針對(duì)導(dǎo)致AIDS的HIV-1和針對(duì)導(dǎo)致兒童呼吸道感染的呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的支柱。 針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的疫苗開發(fā)處于臨床前階段，針對(duì)HIV-1的疫苗已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，針對(duì)RSV的疫苗處于I期。復(fù)旦大學(xué)與ID Pharma Co.Ltd.合作開發(fā)預(yù)防COVID-19的疫苗。在該項(xiàng)目中，SeV充當(dāng)疫苗骨架載體。

病毒結(jié)構(gòu)

? ? ? ? 仙臺(tái)病毒是一種有包膜的病毒：它的外層是一個(gè)脂質(zhì)包膜，里面含有糖蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)，具有兩種酶活性(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。血凝素(H)用作細(xì)胞附著因子和膜融合蛋白。神經(jīng)氨酸酶(NA)是一種唾液酸酶，可從宿主細(xì)胞表面切割并去除唾液酸。 這種切割促進(jìn)了病毒脂質(zhì)包膜與細(xì)胞外膜的融合。

? ? ? ?在病毒的脂質(zhì)包膜中還存在融合蛋白(F)，也是一種糖蛋白，可確保病毒在病毒吸附后進(jìn)入宿主細(xì)胞。 脂質(zhì)膜下方是基質(zhì)蛋白(M)；它形成病毒包膜的內(nèi)層并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。SeV病毒粒子含有核衣殼核，核衣殼核由基因組RNA、核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)組成。磷蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶(RDRP)的病毒的一個(gè)基本亞基，而大蛋白(L)是該聚合酶的一個(gè)催化亞基。C蛋白由P基因編碼mRNA的另一個(gè)閱讀框翻譯而來(lái)，它也與病毒衣殼相關(guān)。它在SeV病毒粒子中存在的水平相對(duì)較低(40個(gè)分子/基因組)。

病毒基因組

? ? ? ? 非分段反義RNA病毒的基因組同源重組率低，進(jìn)化相對(duì)緩慢。造成這種基因組穩(wěn)定性的原因可能有多種：(1)這些病毒的基因組是非分段的，因此不能進(jìn)行基因重排。(2)每種蛋白質(zhì)和每種氨基酸都具有重要的功能。 因此，任何新的基因插入、替換或缺失都會(huì)導(dǎo)致功能降低或完全喪失，進(jìn)而導(dǎo)致新病毒變體的生存能力降低。(3)仙臺(tái)病毒屬于受“六堿基法則”支配的病毒。SeV基因組作為其他副粘病毒的基因組主要包括六個(gè)基因，編碼六個(gè)主要蛋白質(zhì)。副粘病毒中同源 RNA 重組率低可能是由于這種對(duì)多六聚體長(zhǎng)度(6n)不尋常的基因組要求造成的。SeV的天然高基因組穩(wěn)定性是其潛在用作疫苗載體或溶瘤劑的積極特征。對(duì)于任何臨床或工業(yè)應(yīng)用，重要的是SeV基因組和插入的外源轉(zhuǎn)基因?qū)⒁苑€(wěn)定的方式表達(dá)。遺傳穩(wěn)定性能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚中進(jìn)行多次連續(xù)傳代，而不會(huì)發(fā)生病毒基因組變化。

細(xì)胞蛋白酶的蛋白水解切割

? ? ?? SeV F蛋白是一種I型膜蛋白，由無(wú)活性前體(F0)合成，必須通過(guò)殘基精氨酸116處的蛋白水解裂解激活。裂解F0前體后產(chǎn)生兩個(gè)二硫鍵連接的亞基F1和F2。副粘病毒使用不同的宿主細(xì)胞蛋白酶來(lái)激活它們的F蛋白。 仙臺(tái)病毒使用活化蛋白酶，即以類胰蛋白酶β2-(TPSB2)為代表的絲氨酸內(nèi)肽酶，如類胰蛋白酶II、類胰蛋白酶Clara、團(tuán)狀細(xì)胞類胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶) 胰蛋白酶1 (PRSS1)、?微型纖溶酶 (PLG)和跨膜絲氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)。最有可能的是，凝血因子X(jué) (F10) 能夠切割和激活SeV F0。其他尚未鑒定的細(xì)胞蛋白酶也可能處理SeV的F0蛋白。

SeV細(xì)胞進(jìn)入受體

? ? ? ?包膜中含有HN的呼吸道病毒、禽腮腺炎病毒和大多數(shù)腮腺炎病毒株使用唾液酸作為它們的細(xì)胞進(jìn)入受體。SeV作為呼吸道病毒的代表，使用含有唾液酸殘基的分子，如糖蛋白和鞘糖脂(神經(jīng)節(jié)苷脂)。SeV也可以使用凝集素進(jìn)入細(xì)胞，三種SeV受體由分化簇的分子代表。一些SeV受體在癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，因此，SeV可以在癌細(xì)胞內(nèi)繁殖。

生命周期

? ? ? ?由于 SeV 是一種反義RNA病毒，病毒的整個(gè)生命周期都是在細(xì)胞質(zhì)中使用其自身的RNA聚合酶完成的。

吸附與融合

? ? ? ? 仙臺(tái)病毒通過(guò)識(shí)別特定受體分子介導(dǎo)的宿主細(xì)胞吸附來(lái)啟動(dòng)感染過(guò)程。血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)作為一種病毒細(xì)胞附著蛋白，與特定的細(xì)胞進(jìn)入受體相互作用。HN具有唾液酸酶活性，能夠從細(xì)胞受體上切割唾液酸殘基。 這種切割觸發(fā)了病毒包膜和細(xì)胞膜的融合過(guò)程，通過(guò)HN與病毒融合蛋白(F)的合作促進(jìn)了這一過(guò)程。為了執(zhí)行融合功能，F(xiàn)蛋白必須從其前體無(wú)活性形式F0中被蛋白水解激活，這種激活需要在病毒吸附之前由宿主蛋白酶進(jìn)行F0切割。

脫殼

? ? ? ?在宿主膜和病毒包膜合并后，根據(jù)一種模型，SeV被“脫殼”，病毒包膜蛋白擴(kuò)散到宿主質(zhì)膜中。根據(jù)另一種模型，病毒不會(huì)將其包膜蛋白釋放到宿主膜中。 病毒膜和宿主膜融合在一起，形成連接結(jié)構(gòu)。 這種連接結(jié)構(gòu)充當(dāng)病毒核糖核蛋白(RNP)的運(yùn)輸“高速公路”。因此，RNP 穿過(guò)連接結(jié)構(gòu)到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，允許SeV遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制

? ? ? ? ?一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，SeV基因組RNA就會(huì)作為模板參與由依賴于RNA的RNA聚合酶(由L和P蛋白組成)執(zhí)行的兩種不同的RNA合成過(guò)程：轉(zhuǎn)錄以生成mRNA和RNA依賴RNA聚合酶促進(jìn)mRNA甲基化帽結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。?

? ? ? ? NP蛋白被認(rèn)為具有結(jié)構(gòu)和功能作用這種蛋白質(zhì)濃度被認(rèn)為調(diào)節(jié)從RNA轉(zhuǎn)錄到RNA復(fù)制的轉(zhuǎn)換?；蚪MRNA作為病毒RNA轉(zhuǎn)錄的模板，直到NP蛋白濃度增加。隨著NP蛋白的積累，發(fā)生從轉(zhuǎn)錄到復(fù)制的轉(zhuǎn)變。NP蛋白包裹基因組RNA，形成螺旋核衣殼，它是病毒 RNA 聚合酶合成RNA的模板。該蛋白質(zhì)是以下復(fù)合物NP-P、NP-NP、NP-L和RNA-NP的重要成分。所有這些復(fù)合物都是病毒RNA復(fù)制所必需的。?

翻譯

? ? ? ?? 從病毒mRNA翻譯出兩組不同的蛋白質(zhì)。 第一組由六種結(jié)構(gòu)蛋白代表，包括核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和大蛋白(L)。所有這些蛋白質(zhì)都具有不同的功能并被整合到病毒核衣殼中。 第二組由七個(gè)非結(jié)構(gòu)或輔助蛋白質(zhì)代表。這些蛋白質(zhì)是從P基因的多順?lè)醋觤RNA翻譯而來(lái)的。該mRNA編碼八種翻譯產(chǎn)物，P蛋白只是其中之一。翻譯的替代變體由V、W、C、C'、Y、Y'和X蛋白表示。蛋白質(zhì)C'、C、Y1、Y2是mRNA替代閱讀框的產(chǎn)物，它們統(tǒng)稱為C-蛋白質(zhì)或C-嵌套蛋白質(zhì)，它們共享共同的C-末端。X蛋白也共享相同的C末端，其翻譯也由核糖體獨(dú)立啟動(dòng)。蛋白質(zhì)V和W是共轉(zhuǎn)錄mRNA編輯的產(chǎn)物。 所有這些非結(jié)構(gòu)蛋白都具有多種功能，包括組織病毒RNA合成和通過(guò)逃避宿主先天免疫幫助病毒感染宿主細(xì)胞

病毒蛋白向細(xì)胞膜的運(yùn)輸

? ? ? ? 翻譯后，為出芽過(guò)程做準(zhǔn)備，三種病毒親脂蛋白HN、F和M遷移到宿主細(xì)胞膜并與之結(jié)合。?

?合胞體形成和直接細(xì)胞間感染傳播

? ? ? ??兩種SeV蛋白：HN和F，在它們直接與細(xì)胞膜結(jié)合后，會(huì)促進(jìn)胞間融合，從而形成大的多核細(xì)胞(合胞體)。 這種形成涉及受感染細(xì)胞與相鄰靶細(xì)胞的融合，并且仍然是病毒成分在細(xì)胞間直接傳播的重要機(jī)制。 因此，在部分組裝的病毒粒子中以遺傳物質(zhì)形式存在的SeV感染可以在不暴露于宿主中和抗體的情況下傳播。

出芽

? ? ? ? 仙臺(tái)病毒與所有其他包膜病毒一樣，使用宿主細(xì)胞膜脂雙層來(lái)形成病毒衣殼膜。 病毒蛋白(M、HN和F)與宿主細(xì)胞膜的結(jié)合促進(jìn)了它們與 RNP 復(fù)合物的相互作用，該復(fù)合物由與SeV 蛋白(NP、P 和 L)結(jié)合的病毒基因組RNA組成。因此，所有病毒結(jié)構(gòu)成分，包括病毒糖蛋白和基因組RNP復(fù)合物，都組裝在一起。 在這種組裝之后，感染性病毒顆粒從單獨(dú)或集體感染的細(xì)胞(合胞體)中出芽釋放。C蛋白通過(guò)與AIP1/Alix相互作用促進(jìn)出芽，AIP1/Alix是一種參與細(xì)胞凋亡和內(nèi)體膜運(yùn)輸?shù)乃拗鞯鞍?。傳染性病毒顆粒通常在感染后24小時(shí)(hpi)釋放，峰值滴度出現(xiàn)在48至72hpi之間

持續(xù)感染

? ? ? ? ?仙臺(tái)病毒可以在其宿主細(xì)胞中建立持續(xù)感染，多輪病毒傳代培養(yǎng)產(chǎn)生具有高建立持續(xù)感染能力的新病毒變體。這些SeV變體會(huì)產(chǎn)生某些基因型變化。持續(xù)感染也可以在干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)敲低細(xì)胞中立即建立。IRF-3是一種關(guān)鍵的促凋亡蛋白，在被 SeV 激活后會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。IRF-3敲除細(xì)胞表達(dá)病毒蛋白并產(chǎn)生低水平的感染性病毒粒子。IRF-3通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞凋亡和阻止持久性建立來(lái)控制SeV感染細(xì)胞的命運(yùn)； 因此，它的敲除允許持久性發(fā)生。據(jù)報(bào)道，在SeV感染復(fù)制期間，缺陷病毒基因組(DVG)正在形成并選擇性地保護(hù)宿主細(xì)胞亞群免于死亡，從而促進(jìn)持續(xù)感染的建立。在自然界中，地方性動(dòng)物疾病模式表明該病毒可以潛伏并在一年內(nèi)被清除。

誘導(dǎo)細(xì)胞融合

? ? ? ? 仙臺(tái)病毒與其所在的呼吸道病毒成員共有的一個(gè)公認(rèn)特征是在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)體內(nèi)和體外合胞體形成的能力。合胞體的形成有助于病毒在感染傳播過(guò)程中避免中和宿主生物的抗體。這一過(guò)程的機(jī)制已被很好地理解，并且與病毒粒子為促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入而采用的融合過(guò)程非常相似。 受體結(jié)合血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白的活性僅負(fù)責(zé)誘導(dǎo)病毒包膜和細(xì)胞膜之間的密切相互作用。

? ? ? ? 當(dāng)被局部脫水和結(jié)合的HN蛋白的構(gòu)象變化時(shí)，F(xiàn)蛋白主動(dòng)插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致病毒包膜和細(xì)胞膜融合，隨后不久病毒粒子進(jìn)入。當(dāng)HN和F 蛋白由細(xì)胞制造并在表面表達(dá)時(shí)，相鄰細(xì)胞之間可能會(huì)發(fā)生相同的過(guò)程，導(dǎo)致廣泛的膜融合并導(dǎo)致合胞體的形成。?

? ? ? ? 科勒和米爾斯坦利用了SeV的這種行為，他們?cè)?1975 年發(fā)表了一篇文章，概述了制造單克隆抗體的革命性方法。需要一種可靠的方法來(lái)生產(chǎn)大量的特異性抗體，兩者合并了一個(gè)暴露于選定抗原的單克隆B細(xì)胞和一個(gè)骨髓瘤腫瘤細(xì)胞，以產(chǎn)生雜交瘤，能夠無(wú)限生長(zhǎng)并產(chǎn)生大量的特異性靶向所選抗原的抗體。 雖然后來(lái)發(fā)現(xiàn)了更有效的方法來(lái)創(chuàng)造這種混合體，但科勒和米爾斯坦首先使用仙臺(tái)病毒來(lái)創(chuàng)造他們的革命性細(xì)胞。

基因工程

? ? ? ? 自1950年代后期以來(lái)，研究界對(duì)SeV的了解越來(lái)越多，并且它已被廣泛用于創(chuàng)建基因工程構(gòu)建體的多種變體，包括用于轉(zhuǎn)基因遞送的載體。與其他病毒相比，SeV基因構(gòu)建體的創(chuàng)建更容易，許多SeV基因具有轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)。 因此，構(gòu)建重組病毒很簡(jiǎn)單； 可以通過(guò)替換或添加病毒蛋白表達(dá)基因?qū)⑼庠椿蛞氩《净蚪M。SeV可以包含一個(gè)外源基因甚至多個(gè)大基因。已經(jīng)證明可以在SeV中插入和表達(dá)超過(guò)3kb的基因。由于完全是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制，該病毒不會(huì)攜帶遺傳整合到宿主基因組中的風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)于許多其他病毒載體來(lái)說(shuō)是一個(gè)問(wèn)題。SeV的基因組與其他非分段反義RNA病毒的基因組一樣，同源重組率低，進(jìn)化相對(duì)緩慢。 存在這種基因組穩(wěn)定性的多種原因：(1)基因組是非分段的，因此不能進(jìn)行遺傳重配，(2)每種蛋白質(zhì)和每種氨基酸都具有重要的功能。 因此，任何新的基因插入、替換或缺失都會(huì)導(dǎo)致功能降低或完全喪失，進(jìn)而導(dǎo)致新病毒變體的生存能力降低。(3)仙臺(tái)病毒屬于受“六堿基法則”支配的一類病毒。SeV基因組作為其他副粘病毒的基因組，主要包括6個(gè)基因，編碼6個(gè)主要蛋白質(zhì)。 副粘病毒中同源RNA重組率低可能是由于這種對(duì)多六聚體長(zhǎng)度(6n)不尋常的基因組要求造成的。SeV 的天然高基因組穩(wěn)定性是其潛在用作疫苗載體或溶瘤劑的積極特征。對(duì)于任何臨床或工業(yè)應(yīng)用，重要的是SeV基因組和插入的外源基因?qū)⒁苑€(wěn)定的方式表達(dá)。由于SeV遺傳穩(wěn)定性，病毒構(gòu)建體在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚中的多次連續(xù)傳代是可能的，而不會(huì)發(fā)生劇烈的基因組變化。

附帶一提

? ? ? ? 在發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒之前，呼吸道病毒、水生動(dòng)物副黏病毒、費(fèi)爾拉病毒與亨尼帕病毒還是屬于麻疹病毒家族。但是隨著仙臺(tái)病毒的發(fā)現(xiàn)，它們最終分道揚(yáng)鑣，于是麻疹病毒家族就剩麻疹病毒這一個(gè)獨(dú)苗。

總結(jié)

? ? ? ? 在此對(duì)反義RNA病毒做一個(gè)總結(jié)。反義RNA病毒在RNA復(fù)制時(shí)，不會(huì)形成雙鏈RNA，因此反義RNA基因重組率低。但是，正黏病毒與布尼亞病毒基因重組率很高。

? ? ? ?大多數(shù)感染人類的正義RNA病毒與反義RNA病毒很多都是著名的病原體。例如正義RNA病毒中的黃熱病病毒、西尼羅病毒、奇昆古尼亞病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒。例如反義RNA病毒中的狂犬病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒。

? ? ? ?大多數(shù)感染人類的RNA病毒都是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成復(fù)制，只有少數(shù)病毒，例如博爾納病毒、流感病毒、索戈托病毒、夸蘭扎病毒在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制。

? ? ? ?少數(shù)反義RNA病毒，例如博爾納病毒具有類似逆轉(zhuǎn)錄病毒編輯正義RNA的能力以及整合入宿主DNA的能力。一些體外實(shí)驗(yàn)證明，部分反義RNA病毒基因組可以整合入宿主DNA的能力，證明逆轉(zhuǎn)錄病毒是由反義RNA病毒進(jìn)化而來(lái)。

? ? ? ? 下期介紹的病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒。