來源?TMR Publishing Group

作者?Traditional Medicine Research 編輯部

研究亮點

茅莓總皂苷（TSRP）通過抑制體內(nèi)外的Bcl-2、Fas表達，增加體內(nèi)外Bax表達來誘導(dǎo)Raji細胞凋亡。此外，TSRP對控制體外細胞凋亡的線粒體途徑有一定的影響。

研究背景

茅莓（RP）屬薔薇科，現(xiàn)代藥理實驗表明，RP的水提取物具有止血、活血、化瘀的作用，已成功用于治療冠心病、心絞痛等心血管疾病。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，TSRP在體內(nèi)外均可顯著誘導(dǎo)人慢性粒細胞白血病K562細胞凋亡。此外，還發(fā)現(xiàn)TSRP能明顯抑制信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)的磷酸化，增加AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化。高濃度TSRP還可顯著抑制蛋白激酶B (Akt)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化。

淋巴瘤是常見的循環(huán)系統(tǒng)腫瘤。雖然分子靶向治療和嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)在治療淋巴瘤方面取得了很大進展，但聯(lián)合化療仍是目前主要的治療方法。但化療藥物毒性強，且易產(chǎn)生耐藥性。有報道稱TSRP對Hut-78人皮膚T細胞淋巴瘤有抗腫瘤活性，但目前針對TSRP對淋巴瘤的抑制作用的機制研究還甚少。與此同時，通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)口服RP可以減少淋巴瘤患者的發(fā)熱和盜汗。因此，我們探究了TSRP對淋巴瘤的影響，為確定該種抑制淋巴瘤細胞惡性增殖的有效成分提供了依據(jù)。

研究方法

淋巴瘤裸鼠模型的建立及分組

將Raji淋巴瘤細胞通過皮下移植到3周齡BALB裸鼠的左腋窩。劑量為0.2 mL /只，共20只小鼠（其中5只未形成腫瘤），培養(yǎng)2周。將形成腫瘤的裸鼠隨機分為三組，每組5只：①對照組(生理鹽水)；② TSRP低劑量組(20 mg / kg )；③ TSRP高劑量組(100 mg / kg )。

TSRP在體內(nèi)外對淋巴瘤Raji的抑制作用的分析

分析比較不同濃度TSRP處理后移植瘤的體積、重量和抑制率。分別用TUNEL法和免疫組織化學(xué)法檢測細胞凋亡和Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表達。用MTT法檢測TSRP對細胞增殖的影響。用DAPI染色和蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3）、Bcl-2、Bax和Fas蛋白的表達。

結(jié)果

TSRP對淋巴瘤細胞的抑制作用

TSRP低劑量組和高劑量組腫瘤的重量明顯低于對照組。高劑量和低劑量TSRP組對移植瘤小鼠的抑瘤率分別為90.84%和27.96%，與對照組有顯著差異(P < 0.001，表1)，表明TSRP對淋巴瘤具有抑制作用，且高劑量TSRP的抑制作用更好。

TSRP治療后移植瘤大小的變化

隨著治療的推進，與對照組相比，TSRP低劑量組和高劑量組的腫瘤大小均顯示出顯著差異。表明TSRP在體內(nèi)能強烈抑制Raji細胞的生長(表2)。

腫瘤細胞凋亡的TUNEL分析

凋亡細胞在激光共聚焦顯微鏡(×200)下進行熒光分析。高劑量組的凋亡細胞比對照組多且呈中心分布。利用徠卡共聚焦軟件，定量分析了三組淋巴瘤凋亡細胞的熒光強度(P < 0.001，圖1)。結(jié)果表明TSRP在體內(nèi)通過促進細胞凋亡抑制淋巴瘤細胞的生長。

免疫組織化學(xué)分析確定移植腫瘤的Bcl-2、Bax和Fas的表達

結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)TSRP處理的腫瘤Raji細胞的Bcl-2、Fas表達均明顯降低，而Bax的表達明顯增加。這表明TSRP通過降低Bcl-2、Fas的表達，增加Bax的表達誘導(dǎo)Raji細胞凋亡(圖2)。

TSRP對Raji細胞增殖的抑制作用的MTT分析

MTT法顯示100 - 400 μg / mL TSRP對Raji細胞的抑制作用呈劑量依賴性(P < 0.001，表3)。這表明TSRP在體外對淋巴瘤細胞生長具有相當(dāng)強的抑制作用。

DAPI染色觀察TSRP誘導(dǎo)Raji細胞凋亡

對照組細胞核呈規(guī)則圓形，染色均勻。隨著TSRP濃度的增加，細胞核破裂，形成被細胞膜包裹的不同大小的圓形體(稱為凋亡體)，能明顯觀察到細胞凋亡(圖3)。表明TSRP能在體外誘導(dǎo)Raji細胞凋亡。

蛋白印跡分析評估Bcl-2、Bax、Fas、Caspase-9和Caspase-3的表達

TSRP的加入顯著抑制了Raji細胞中Bcl-2、Fas的活性，增加了Bax的活性并呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明TSRP通過抑制Bcl-2、Fas表達，增加Bax表達誘導(dǎo)細胞凋亡。同時研究發(fā)現(xiàn)Caspase-9和Caspase-3的表達也隨著TSRP濃度的增加而增加(圖4，表4)，表明TSRP在體外通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。但仍需進一步的體內(nèi)實驗來證實這些結(jié)果。

結(jié)論

TSRP通過在體內(nèi)和體外抑制Bcl-2、Fas表達，增加Bax表達誘導(dǎo)Raji細胞凋亡。此外，TSRP對控制體外細胞凋亡的線粒體途徑有一定的影響。

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引用格式

Xu XF, Cheng RB, Zhang XJ, Gao RL. Total saponins in Rubus parvifolius L.induce lymphoma cells apoptosis through upregulated Bax/Fas and downregulated Bcl-2 in vivo and in vitro. Tradit Med Res. 2019;4(2):99–108. doi:10.53388/TMR20190304108

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