前言

2021年12月，上海交通大學張荻課題組在Frontiers in Plant Science發(fā)表題為 TMT-Based Quantitative Proteomic Analysis Reveals the Physiological Regulatory Networks of Embryo Dehydration Protection in Lotus(Nelumbo nucifera)的研究成果，通過TMT標記蛋白質組學和平行反應監(jiān)測蛋白靶向驗證(PRM)技術研究方法，構建了蓮花胚胎脫水保護的生理調控網絡。為揭示荷花種子長壽的脫水保護機制提供了新的見解。

中文標題：基于TMT定量蛋白質組學分析揭示了蓮花胚胎脫水保護的生理調控網絡

研究對象：蓮花

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

影響因子：5.753

發(fā)表時間：2021.12

合作單位：上海交通大學

運用生物技術：TMT標記定量蛋白質組學、PRM蛋白靶向驗證由鹿明生物提供技術支持

研究背景

蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)是一種古老的水生植物，屬于蓮科，含兩個種，N. nucifera和N. lutea，分別被命名為中國蓮和美國蓮。蓮是中國十大名花之一，它在中國作為食用和藥用植物栽培已有7000多年的歷史。蓮的種子是黑色的、硬的、卵圓形，在它未成熟階段，種子含水量較高，外部被綠色果皮所包被，內部具有發(fā)育的種胚。當種子達到成熟時，外殼堅硬并轉變?yōu)榘岛稚N胚大量失水。蓮子具有長壽和極耐儲存的特點，被譽為"千年古蓮"。二十世紀初，在中國遼寧省的泥炭層中挖掘出一些古蓮子，它們仍能正常發(fā)芽和生長。根據(jù)14C同位素檢測，這些種子的壽命超過1300年，是壽命最長的種子之一。蓮作為水生植物，營養(yǎng)器官和種胚對脫水過程的反應存在巨大差異與其胚胎發(fā)育中特殊的保護機制有關。

研究思路

研究方法

1. 樣本策略：

蓮花(N. nucifera "TaiKong 36")種子于2018年夏季在上海交通大學的自然條件下的栽培基地中獲得。每天早上對荷花植物進行人工授粉，并記錄時間。在授粉后15、18、21、24、27、30、40和50天收集不同發(fā)育階段中的種子。去除種皮和子葉組織，收集0.2克的荷花胚胎并儲存在離心管中，立即冷凍在液氮中，并儲存在-80℃。

2. 常規(guī)檢測：

生理學測量、相對含水量(RWC)——對不同發(fā)育階段的胚胎進行加權計算鮮重(FW)，然后在70℃下干燥以獲得恒重(DW)、抽提荷花胚胎中的總蛋白，并進行BCA法定量。

3. 組學研究：

TMT標記定量蛋白質組學分析、PRM靶向蛋白驗證

研究結果

發(fā)育和脫水蓮子胚胎的特征

蓮子的整個發(fā)育和成熟過程大約需要40天，在此期間，種胚和果皮的形態(tài)和顏色發(fā)生明顯改變（圖1A）。在第一階段，種胚主要進行胚胎發(fā)育。胚胎在18-21天達到形態(tài)成熟，種胚和果皮呈現(xiàn)鮮綠色，種胚的鮮重達到最大值，干物質在此階段迅速積累（圖1）。第二階段，蓮子在授粉后21-50天進入脫水成熟階段，種胚和果皮形態(tài)上逐漸萎縮，顏色逐漸變加深（圖1A）。

圖1 蓮子胚胎的發(fā)育和脫水特征。

(A)發(fā)育中的蓮子的形態(tài)特征；(B)發(fā)育中的蓮子胚的鮮/干重和相對水含量；(C)發(fā)育中的蓮子胚的可溶性蛋白和糖含量。小寫字母表示該指標在不同發(fā)育階段有顯著差異；P < 0.05。

TMT標記定量蛋白質組學和DEP篩選

采用TMT標記定量蛋白質組學技術對三個脫水特殊階段（21、27和40DAP）的新鮮蓮種胎進行了蛋白質組學分析，共鑒定了5,477個蛋白質。對測試樣本進行了PCA分析，結果顯示，不同組間樣品具有很好的區(qū)分，每組的三個重復樣本被聚集在一起。PCA的前兩個成分占總方差的70％以上（圖2A）。三個試驗組之間共有815個差異表達蛋白。其中，198個（32%）和198個（26%）蛋白質豐度增加，而420個（68%）和558個（74%）蛋白質豐度在27DAP和40DAP組分別下降（圖2B）。只有30個蛋白質的豐度在27DAP和40DAP組之間具有顯著變化（圖2C）。

圖2 蛋白組整體差異情況

DEGs的生物信息學分析

在種胚脫水成熟期，從蓮種胚中鑒定獲得的815個DEPs采用了層次聚類和蛋白質功能分類分析（圖3）。所有的DEPs被分為5個主要的表達譜系。聚類A（包含16個蛋白）和聚類B（566個蛋白）包含持續(xù)下調的DEP，聚類C（39個蛋白）和聚類E（185個蛋白）在種胚脫水過程中逐漸上調。聚類D僅包含4個在快速脫水階段（27DAP）特異性上調表達的蛋白，包括脫水素蛋白RAB18（A0A1U7ZRR9）、二半乳糖二酰甘油合成酶（A0A1U7ZHL0）、蛋白質TORNADO（A0A1U7ZLU9）和一個未知功能蛋白（A0A1U8B9X3）。

圖3 差異蛋白表達譜系

蛋白質相互作用網絡分析

蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡分析是基于不同種子脫水階段的DEPs而進行的，即618個來自快速脫水階段(27/21 DAP)的DEPs和30個來自脫水末期階段(40/27 DAP)的DEPs。在快速脫水階段，上調的DEPs相互作用，參與"半乳糖代謝"、"糖酵解/糖異"、"內質網的蛋白質加工"、"淀粉和蔗糖代謝"。

脫水素蛋白Rab18-like(A0A1U7ZR9)、STAR-1Family DOT2(A0A1U8A3P7)和digalactosyldiacylglycerolsynthase(A0A1U7ZHL0)，在這個網絡中的蛋白豐度的折疊變化最高（圖4）。

圖4 PPI網絡圖

?PRM蛋白靶向驗證

為了驗證TMT蛋白組學數(shù)據(jù)，作者選擇了18個與蓮種胚脫水保護功能密切相關的候選DEPs進行PRM蛋白靶向驗證。PRM鑒定了18個候選DEPs。這些蛋白質的表達模式在PRM和TMT的定量結果之間顯示出類似的趨勢。然而，PRM檢測到的蛋白豐度的倍數(shù)變化值要大于TMT數(shù)據(jù)。這一結果在很大程度上支持了TMT數(shù)據(jù)的可靠性。

應激生理指標的驗證

基于TMT標記定量蛋白質組學的生物信息學分析，對脅迫生理指標進行了測定，以驗證蓮種胚脫水的保護機制。在快速脫水階段，REC和MDA含量的變化與RWC相反，它們的水平迅速增加（圖6A，B）。ABA含量在快速脫水和脫水成熟階段前略有增加（圖6C）。上述指標的變化趨勢表明，ABA作為上游信號參與了脫水誘導過程，在快速脫水階段，蓮種胚發(fā)生了嚴重的膜脂過氧化和質膜損傷。在18-27DAP期間，O和OH抑制活性明顯降低，HO水平增加了7倍（圖6D-F），這表明在蓮種胚脫水過程中產生了過多的ROS組分。

圖6?應激生理指標的驗證

研究討論

本研究采用TMT標記定量蛋白質組學方法，揭示了荷花胚胎連續(xù)脫水和成熟過程中不同的蛋白質譜系。生物信息學分析表明，環(huán)境刺激、應激反應和蛋白質加工相關的生物過程非?；钴S，碳水化合物代謝、ER中的蛋白質加工、DNA修復和抗氧化事件對荷花胚胎脫水有積極反應。此外，HO是誘發(fā)氧化應激損傷的主要ROS組分，GSH和VE作為主要的抗氧化劑，維持了荷花胚胎的REDOX平衡。ABA信號和低聚糖、LEA和HSP的積累可能是保證荷花種胚持續(xù)脫水和耐儲藏性的關鍵因素。今后的研究重點是確定LEA、HSP和寡糖合成相關的關鍵蛋白的生物學意義，這對利用分子輔助育種或基因工程技術提高植物對脫水的耐受性具有很大價值。

小鹿推薦

本研究采用串聯(lián)質量標簽（TMT）標記的蛋白質組學和平行反應監(jiān)測（PRM）技術，對蓮子脫水過程中的生理調控網絡進行了深入研究表明，碳水化合物代謝（包括糖酵解/糖異成、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、磷酸戊糖途徑和細胞壁組織）、ER中的蛋白質加工、DNA修復和抗氧化事件對蓮種胎脫水有積極的反應。在蓮種胚脫水過程中，非酶促抗氧化劑和戊糖磷酸酶途徑在抗氧化保護中起著主要作用。應激生理學檢測表明，H2O2是誘發(fā)氧化應激損傷的主要活性氧（ROS）成分，谷胱甘肽和維生素E作為主要的抗氧化劑，在脫水過程中維持荷花胚胎的REDOX平衡。這些結果為揭示荷花胚胎脫水保護機制的生理學調控網絡提供了新的見解。

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文末看點｜lumingbio

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