在 CRISPR/Cas9 基因編輯治療中，小型基因編輯工具可以搭載 AAV 病毒進(jìn)入體內(nèi)，是基因治療的理想工具。不同型號(hào)的基因編輯工具是否適合用于基因治療，取決于這把 “魔剪” 基因大小是否能搭載 AAV 病毒載體。

日前，復(fù)旦大學(xué)王永明課題組聯(lián)合王紅艷課題組從耳氏葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了一把小型的基因編輯工具并將其命名為 SauriCas9.這把玲瓏的 “剪刀”在基因組中可編輯的位點(diǎn)數(shù)量和經(jīng)典的 SpCas9 一樣多，而比另一種小型基因編輯工具 SaCas9可編輯位點(diǎn)更多。該研究成果填補(bǔ)了我國(guó)在鑒定小型CRISPR-Cas9工具領(lǐng)域的空白。新的小型基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有基因編輯工具的不足。相關(guān)研究成果于近日在線發(fā)表于《公共科學(xué)圖書館：生物學(xué)》

兼具活性和編輯范圍優(yōu)勢(shì)

第三代基因編輯技術(shù) CRISPR技術(shù)讓基因治療的研究邁上了一個(gè)新臺(tái)階。在自然界中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，首先將入侵噬菌體和質(zhì)粒 DNA 的片段整合到CRISPR 中，然后表達(dá)出相應(yīng)的 CRISPR RNA（crRNA）來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性。王永明告訴科技日?qǐng)?bào)記者，CRISPR/Cas9 技術(shù)主要面臨兩個(gè)核心問題，一個(gè)是如何避免脫靶，另外一個(gè)是如何擴(kuò)展編輯范圍。新的小型基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)主要針對(duì)后者展開的研究。

與其他小型基因編輯工具相比，SauriCas9相當(dāng)于一把靈活而鋒利的小型 “剪刀”，能夠包裝在 AAV病毒內(nèi)，且活性高，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)比以往發(fā)現(xiàn)的小型基因編輯工具更大的編輯范圍。SauriCas9 通過 AAV 病毒包裝后，在多種細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)了基因編輯，說明 SauriCas9 具有用于基因治療的潛力。

“SauriCas9 基因大小為 3100個(gè)堿基對(duì)，與另一種小型基因編輯工具 SaCas9 大小差不多，同時(shí)比經(jīng)典的 SpCas9 要小 1000 個(gè)堿基對(duì)。SaCas9 比SpCas9 小很多，但是編輯范圍不如 SpCas9 大。” 王永明表示，SaCas9來源于金黃色葡萄球菌，是第一個(gè)被用于基因治療研究的小型基因編輯工具。另外還有 3 個(gè)小型編輯工具NmCas9、Nme2Cas9、CjCas9，但是它們的編輯效率偏低。SpCas9 來源于化膿性鏈球菌，雖然編輯范圍大，但是不能被包裝在 AAV病毒中，用于基因治療面臨困難。

基因編輯工具的來源不同，基因編輯范圍和效率也不同。SpCas9 是所有基因編輯工具中效率最高的，同時(shí)編輯范圍也大?！癝auriCas9出現(xiàn)兩個(gè)連續(xù)的 G 序列就可以進(jìn)行編輯，而 SaCas9 需要 4 個(gè)堿基組合才能編輯，這樣出現(xiàn)的頻率低，編輯范圍就不如 SauriCas9大。” 王永明說。

王永明課題組對(duì)公共數(shù)據(jù)庫中的 30 個(gè)不同種類 CRISPR/Cas9 進(jìn)行一一測(cè)試驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其他 29 個(gè) Cas9 均不適合用于基因編輯，只有 SauriCas9 具有編輯活性，很適合作為基因編輯治療的工具。

用于藥物靶點(diǎn)的高通量篩選

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括兩個(gè)元件，分別是 Cas9 內(nèi)切酶和 guide RNA（gRNA），gRNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，形成 DNA雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)雙鏈斷裂的 DNA 時(shí)，會(huì)定點(diǎn)產(chǎn)生突變，這就是基因編輯。以往 SpCas9通過與氨基酸融合實(shí)現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換。在發(fā)現(xiàn)了 SauriCas9之后，研究團(tuán)隊(duì)將其與氨基酸融合制作了兩種新的堿基編輯器——SauriCas9BE4max 和 SauriCas9ABEmax,分別可以實(shí)現(xiàn)C-T 或 A-G 兩種堿基轉(zhuǎn)換?！坝捎?SauriCas9 可以識(shí)別更多的位點(diǎn)，其編輯器的修復(fù)范圍也相應(yīng)比 SaCas9 更大?！?王永明說。

CRISPR/Cas9技術(shù)的安全性也是科學(xué)家研究的關(guān)注點(diǎn)，通常與基因編輯工具的精準(zhǔn)度相關(guān)。據(jù)王永明介紹，基因治療方式可以分為兩種，一種是將細(xì)胞從體內(nèi)分離出來，在體外進(jìn)行突變糾正，然后再輸回體內(nèi)。另外一種治療方式是將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)直接導(dǎo)入體內(nèi)治療疾病。但是 CRISPR/Cas9 技術(shù)可能會(huì)造成脫靶修飾，帶來難以預(yù)料的風(fēng)險(xiǎn)。

SauriCas9 的精準(zhǔn)度介于 SpCas9與 SaCas9 之間。SaCas9 的精準(zhǔn)度更好，意味著更具安全性。研究組將 SauriCas9 部分序列和 SaCas9基因序列互換，得到了嵌合體 Cas9，保證了精準(zhǔn)度的同時(shí)也能擴(kuò)大編輯范圍，使基因編輯工具得到了進(jìn)一步優(yōu)化。后續(xù)的研究中，王永明課題組還將對(duì)新的基因編輯工具進(jìn)行安全性測(cè)試驗(yàn)證，擴(kuò)展其在高通量篩選等方面的應(yīng)用?！叭祟惔蠹s有 2 萬個(gè)基因，利用CRISPR/Cas9 可以分別敲除這 2 萬個(gè)基因，敲除過程可以用高通量實(shí)現(xiàn)，這樣就可以快速研究這些基因的功能，為藥物研發(fā)提供靶點(diǎn)?！蓖跤烂鹘榻B。

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