氧氣是驅(qū)動(dòng)能量代謝所必需的物質(zhì)。腫瘤的快速增殖導(dǎo)致正常氧水平下降到缺氧水平。所以缺氧是實(shí)體腫瘤的標(biāo)志，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。結(jié)直腸癌（CRC）是一種高致死性的癌癥，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升。腫瘤缺氧與較差的總生存率、無(wú)病生存率和局部區(qū)域控制相關(guān)。環(huán)狀RNA（circRNAs）是內(nèi)源性非編碼RNA，反向剪接成環(huán)，通過(guò)多種作用機(jī)制在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的機(jī)制作用還需進(jìn)一步研究。

2023年4月22日，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院&廣東省結(jié)直腸與盆底疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室梁振興和康亮教授團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer發(fā)表文章A novel protein encoded by circINSIG1 reprograms cholesterol metabolism by promoting the ubiquitin-dependent degradation of INSIG1 in colorectal cancer。作者鑒定了一種名為circINSIG1的新型缺氧反應(yīng)性circRNA，它在CRC組織中上調(diào)，并與晚期臨床分期和不良生存率相關(guān)。circINSIG1編碼一個(gè)由121個(gè)氨基酸組成的蛋白circINSIG1-121，通過(guò)募集CUL5-ASB6復(fù)合物（一種泛素E3連接酶復(fù)合物）促進(jìn)關(guān)鍵膽固醇代謝調(diào)節(jié)因子INSIG1在賴(lài)氨酸156和158位的K48泛素化，從而誘導(dǎo)膽固醇生物合成以促進(jìn)CRC增殖和轉(zhuǎn)移。原位異種移植腫瘤模型和患者來(lái)源的異種移植模型進(jìn)一步確定了circINSIG1在CRC進(jìn)展中的作用和CRC的潛在治療靶點(diǎn)。

缺氧誘導(dǎo)的circINSIG1在CRC中的特征和臨床意義

作者為了鑒定CRC中與缺氧相關(guān)的環(huán)狀RNA，在常氧或缺氧（1%O2、48h）條件對(duì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，三種細(xì)胞系中有18個(gè)環(huán)狀RNA發(fā)生了異常調(diào)控。然后，選擇4種具有相同趨勢(shì)的環(huán)狀RNA進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，并通過(guò)qRT-PCR分析，選擇在CoCl2處理的CRC細(xì)胞系和CRC組織樣本中都顯著上調(diào)的circINSIG1進(jìn)行研究。在85個(gè)CRC樣本中證實(shí)了circINSIG1表達(dá)上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)circINSIG1在T期晚期或臨床分期的患者中表達(dá)較高。circINSIG1是由胰島素誘導(dǎo)基因1（INSIG1）的第3和第4外顯子反向剪接形成的，長(zhǎng)度292nt，在CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富集。

circINSIG1編碼一個(gè)含有121個(gè)氨基酸的蛋白

接著，作者為了確定circINSIG1的蛋白編碼能力，通過(guò)circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，circINSIG1序列中包含一個(gè)可能編碼121個(gè)氨基酸蛋白（以下簡(jiǎn)稱(chēng)circINSIG1-121）和一個(gè)207-292nt的IRES元件；circINSIG1可以在核糖體單體和多聚體組分中檢測(cè)到，以及雙熒光素酶驗(yàn)證IRES具有高活性初步驗(yàn)證circINSIG1具有翻譯多肽的能力。隨后作者構(gòu)建circINSIG1-Flag載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了circINSIG1-121蛋白的內(nèi)源性存在。接下來(lái)，作者通過(guò)IHC和WB分析，發(fā)現(xiàn)circINSIG1-121蛋白在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，而INSIG1蛋白水平在對(duì)應(yīng)的癌旁組織與CRC組織中無(wú)顯著差異，并且較高的circINSIG1-121蛋白表達(dá)與較差的生存率相關(guān)。作者綜合研究結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)信息發(fā)現(xiàn)，線性INSIG1的表達(dá)水平與CRC患者的生存率沒(méi)有相關(guān)性。總之，circINSIG1編碼了一個(gè)121個(gè)氨基酸的新蛋白，與CRC的不良預(yù)后相關(guān)。

circINSIG1-121可促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移

為了闡明circINSIG1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能。作者構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的CRC細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)circINSIG1或circINSIG1-121增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在CRC患者來(lái)源的類(lèi)器官（PDOs）中過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121，結(jié)果顯示也促進(jìn)了PDOs的生長(zhǎng)。此外，敲低circINSIG1或circINSIG1-121則顯著抑制了CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

接著，作者通過(guò)原位異種移植瘤模型來(lái)探究circINSIG1-121在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的體內(nèi)作用。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121顯著促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，并且可導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移腫瘤負(fù)擔(dān)的增加，敲低則相反。另外，過(guò)表達(dá)circINSIG1-ATGmut（突變ATG，使之失去翻譯蛋白功能）并不能增強(qiáng)CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明circINSIG1通過(guò)編碼circINSIG1-121而不是circINSIG1的環(huán)狀RNA形式來(lái)促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上所述，circINSIG1-121翻譯的獨(dú)特蛋白在促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖和轉(zhuǎn)移中的具有關(guān)鍵作用。

circINSIG1-121與INSIG1相互作用，促進(jìn)INSIG1的泛素依賴(lài)性降解以誘導(dǎo)膽固醇的生物合成

為了研究circINSIG1-121促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的分子機(jī)制，作者分析了過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的HCT8和DLD1細(xì)胞中INSIG1的RNA和蛋白水平。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121時(shí)，INSIG1的RNA水平升高，而INSIG1的蛋白水平降低。免疫熒光法和免疫共沉淀法也證實(shí)了circINSIG1-121與INSIG1的相互作用。作者進(jìn)一步研究circINSIG1-121介導(dǎo)的INSIG1降解的分子機(jī)制，在過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的CRC細(xì)胞中，MG132（蛋白酶體抑制劑）提高了INSIG1蛋白水平，INSIG1泛素化水平升高，表明circINSIG1-121通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)INSIG1降解。

甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）在哺乳動(dòng)物的膽固醇和脂質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用。INSIG蛋白與SREBPs和SREBP-裂解激活蛋白（SCAP）復(fù)合物結(jié)合，將該復(fù)合物錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中，以調(diào)節(jié)脂肪生成。作者發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的CRC細(xì)胞中，nSREBP2顯著增加，但nSREBP1沒(méi)有顯著變化，表明circINSIG1-121可能促進(jìn)SREBP2的激活，從而增強(qiáng)膽固醇的生物合成；SREBP2的靶基因的表達(dá)水平升高，SREBP1靶基因的表達(dá)沒(méi)有明顯改變。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circINSIG1-121時(shí)，游離膽固醇含量增加，這與膽固醇生物合成基因表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果一致。綜上所述，circINSIG1-121促進(jìn)了INSIG1的泛素依賴(lài)性降解，導(dǎo)致ER釋放SREBP2-SCAP復(fù)合物，誘導(dǎo)膽固醇的生物合成。

circINSIG1-121招募CUL5-ASB6復(fù)合物以促進(jìn)與K48相連的INSIG1泛素化

為了鑒定導(dǎo)致INSIG1降解的泛素鏈的類(lèi)型，作者用不同的HA標(biāo)記的泛素鏈載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)INSIG1主要與K48鏈泛素化。在circINSIG1-121過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，K48鏈的多泛素化增強(qiáng)。所以，circINSIG1-121通過(guò)K48連接的泛素化介導(dǎo)INSIG1的降解。

然后，作者對(duì)導(dǎo)致INSIG1降解的主要泛素化賴(lài)氨酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行分析。選擇5個(gè)保守的賴(lài)氨酸點(diǎn)分別突變?yōu)榫彼?，以轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，與野生型組相比，轉(zhuǎn)染INSIG1 K156R和K158R的組中INSIG1的蛋白水平略有下降。于是，構(gòu)建了具有兩個(gè)賴(lài)氨酸點(diǎn)突變的INSIG1突變體。結(jié)果表明，該突變體顯著減弱了circINSIG1-121介導(dǎo)的INSIG1的降解，INSIG1的K48連接的泛素化水平顯著低于野生型組。結(jié)果表明，circINSIG1-121促進(jìn)了INSIG1在K156和K158殘基上的K48連接的泛素化。

作者推測(cè)circINSIG1-121可能作為一個(gè)適配器，招募某些E3連接酶泛素化INSIG1。作者鑒定了ASB6的存在，作為一種底物識(shí)別適配器，可以與Cullin5（CUL5）相互作用形成CUL5-ASB6復(fù)合物，作為泛素E3連接酶復(fù)合物。免疫共沉淀法驗(yàn)證了circINSIG1-121和CUL5-ASB6復(fù)合物之間的相互作用。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG132和Cullin-Ring E3連接酶活性抑制劑MLN4924導(dǎo)致內(nèi)源性INSIG1蛋白水平明顯升高。此外，ASB6過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了INSIG1與K48連接的INSIG1泛素化，降低了INSIG1蛋白的豐度。相反，ASB6基因敲低增加了INSIG1蛋白的豐度，并抑制了K48連接的INSIG1泛素化。此外，ASB6的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了膽固醇的生物合成。綜上，circINSIG1-121招募CUL5-ASB6復(fù)合物，促進(jìn)INSIG1在K156和K158位點(diǎn)的K48連接的泛素化。

缺氧誘導(dǎo)的EIF4A3促進(jìn)circINSIG1的表達(dá)

接下來(lái)，作者探究了circINSIG1在CRC細(xì)胞中上調(diào)的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）通過(guò)與側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合參與circRNAs的生物生成。在circINSIG1的后剪接位點(diǎn)的上游和下游分別鑒定出4個(gè)和6個(gè)EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)。WB和qRT-PCR檢測(cè)顯示，缺氧條件下EIF4A3的蛋白表達(dá)上調(diào)，circINSIG1的表達(dá)與EIF4A3的表達(dá)呈正相關(guān)。RNA-pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EIF4A3可以結(jié)合circINSIG1的下游側(cè)翼序列，而不是上游序列。

作者進(jìn)一步構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)EIF4A3的CRC細(xì)胞系和一系列EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)突變的circINSIG1微基因。假定結(jié)合位點(diǎn)的單獨(dú)突變對(duì)circINSIG1的表達(dá)影響不大，而所有6個(gè)EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)的突變則顯著減少了circINSIG1的形成。這些結(jié)果表明，位于circINSIG1下游側(cè)翼區(qū)域的這6個(gè)EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)是EIF4A3介導(dǎo)的circINSIG1循環(huán)化所必需的。此外，作者觀察到過(guò)表達(dá)EIF4A3時(shí)circINSIG1水平升高，反之則降低。此外，EIF4A3的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了SREBP2靶基因的激活和膽固醇生物合成，而沉默circINSIG1可以部分減弱其激活和膽固醇生物合成。綜上所述，缺氧誘導(dǎo)的EIF4A3促進(jìn)了circINSIG1的生物發(fā)生。

circINSIG1是CRC患者潛在的治療靶點(diǎn)

作者分析了六個(gè)患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型中circINSIG1和circINSIG1-121的表達(dá)，選擇circINSIG1上調(diào)的PDX3和PDX6來(lái)檢測(cè)其治療效果。用shcircINSIG1慢病毒治療后，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組。IHC分析顯示，在shcircINSIG1慢病毒處理組中，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著降低。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了circINSIG1在體內(nèi)的作用機(jī)制，下調(diào)circINSIG1降低了circINSIG1-121蛋白水平，并抑制了INSIG1介導(dǎo)的SREBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，在circINSIG1敲低的PDX腫瘤中，游離膽固醇含量降低。綜上所述，circINSIG1是CRC患者的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。

總結(jié)

缺氧誘導(dǎo)了circINSIG1的上調(diào)，而circINSIG1的生物發(fā)生受到EIF4A3的調(diào)控。circINSIG1編碼一種新的蛋白circINSIG1-121，該蛋白招募CUL5-ASB6復(fù)合物，促進(jìn)關(guān)鍵膽固醇代謝調(diào)節(jié)因子INSIG1在賴(lài)氨酸156和158處的K48連接泛素化，從而促進(jìn)膽固醇生物合成和CRC進(jìn)展。circINSIG1提出了一種表觀遺傳機(jī)制，為缺氧和膽固醇代謝之間的關(guān)系提供了新的見(jiàn)解，并為CRC的治療提供了一個(gè)很有前途的潛在治療靶點(diǎn)。