16s+非靶向代謝組學(xué)探究腸道微生物群和抑制通路緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎
前言
2021年7月，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)在Frontiers In Immunology期刊發(fā)表的題為 “Kaempferol Alleviates Murine Experimental Colitis by Restoring Gut Microbiota and Inhibiting the LPS-TLR4-NF-kB Axis ”的研究成果，通過16S rRNA基因測(cè)序和GC-MS非靶向代謝組學(xué)研究方法，探究了山奈酚抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的潛在機(jī)制。
中文標(biāo)題：山奈酚通過恢復(fù)腸道微生物群和抑制 LPS-TLR4-NF-kB 信號(hào)通路來緩解小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎
研究對(duì)象：小鼠結(jié)腸、糞便、血液
發(fā)表期刊：Frontiers In Immunology
影響因子：7.561
發(fā)表時(shí)間：2021年7月
合作單位：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
運(yùn)用生物技術(shù)：16S rRNA基因測(cè)序、GC-MS 非靶向代謝組學(xué)
研究背景
潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是最常見的炎癥性腸?。↖BD），其特點(diǎn)是預(yù)后不良，癥狀復(fù)發(fā)，有可能發(fā)展為結(jié)腸炎相關(guān)癌癥，因此得到廣泛關(guān)注。它與腸粘膜屏障功能缺陷有關(guān)，且特征之一是腸道微生物失調(diào)，因此調(diào)節(jié)腸道微生物群是一種可能的治療策略。山奈酚（Kae）是一種從多種藥用植物中提取的抗炎和抗氧化類黃酮，具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在功效，但其治療效果以及與腸道微生物群之間的聯(lián)系機(jī)制尚未被完全了解。本文作者將山奈酚作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，用于葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠，以考察其治療效果并通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群和影響TLR4相關(guān)信號(hào)通路的潛在作用機(jī)制。
研究思路
(點(diǎn)擊查看大圖)
研究方法
·實(shí)驗(yàn)分組：6周齡C57BL/6J小鼠，分為四組（對(duì)照組NC，山奈酚對(duì)照組Kae、誘導(dǎo)結(jié)腸炎組DSS和山奈酚治療組DSS-Kae），每組10只。
·評(píng)估結(jié)腸炎程度：依據(jù)疾病評(píng)估指數(shù)及組織病理學(xué)結(jié)果
·檢測(cè)促炎因子水平：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
·組學(xué)檢測(cè)：16S rRNA基因測(cè)序、GC-MS非靶向代謝組學(xué)、免疫組織化學(xué)、腸道通透性的測(cè)量
研究結(jié)果
1.山奈酚可以減弱 DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎和觸發(fā)的促炎反應(yīng)
結(jié)腸炎癥評(píng)估結(jié)果顯示，DSS會(huì)引起小鼠嚴(yán)重的腸粘膜損傷（圖1），但口服Kae補(bǔ)充劑會(huì)減輕腸炎癥狀，因此山奈酚可以減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的癥狀，減輕結(jié)腸損傷。
與對(duì)照組相比，DSS處理組結(jié)果表明，DSS引起血清中IL-1、IL-6和TNF-a水平顯著升高。但添加Kae，可以顯著逆轉(zhuǎn)升高趨勢(shì)（圖2A-C）。DSS處理組可以顯著增加炎癥因子（如IL-1b、IL-6、TNF-a、COX-2、MCP-1和iNOS）的mRNA水平表達(dá)，同時(shí)抑制IL-10的表達(dá)（P<0.05）（圖2D）。
此外，DSS組模式識(shí)別受體TLR4和NLRP3以及信號(hào)分子MAPK1和NF-kB的mRNA表達(dá)水平也升高。但服用Kae會(huì)強(qiáng)烈抑制結(jié)腸炎相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)逆轉(zhuǎn)DSS對(duì)IL-10轉(zhuǎn)錄的影響。因此可以得知，Kae可能通過上調(diào)IL-10轉(zhuǎn)錄和下調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，減輕了UC引起的炎癥。
圖1 | 山奈酚減輕了 DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的癥狀
圖2 | 山奈酚對(duì) DSS 和 Kae 治療小鼠組的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響
2.山奈酚可預(yù)防腸屏障喪失完整性
為評(píng)估 Kae 給藥對(duì)腸屏障完整性的保護(hù)作用，測(cè)量了攝入的 FITC-葡聚糖的熒光光譜，并使用 qRT-PCR和免疫組織化學(xué)進(jìn)行了緊密連接 (TJ) 基因表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果表明，與僅服用DSS小鼠相比，Kae處理組的腸道通透性有所改善（圖3A）。DSS處理導(dǎo)致ZO-1、occludin 和 claudin-1 表達(dá)水平降低，而在Kae處理的小鼠中，它們的表達(dá)與未處理的對(duì)照小鼠相似（圖 3B-E）。這些數(shù)據(jù)表明，Kae 通過維持腸道屏障完整起到抗炎作用。
圖3 | Kae可改善腸道通透性并增強(qiáng)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)
3.山奈酚可重塑腸道微生物群的多樣性和豐富性
作者還通過16S rRNA基因高通量測(cè)序，揭示 Kae對(duì)腸道微生物群的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NC組的腸道微生物群組成與DSS組不同。聚類結(jié)果表明，DSS-Kae組位于與DSS組不同分支上，且靠近NC和Kae組（圖4E-G），表明服用Kae可維持小鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。
如圖5A所示，DSS處理會(huì)導(dǎo)致擬桿菌門和厚壁菌門菌群的豐度明顯下降，而變形菌門的豐度增加。但服用Kae 可防止厚壁菌門/擬桿菌門比率的降低（圖 5B）。LEfSe 分析也顯示，DSS 組中的致病菌的 LDA 評(píng)分大于4。但DSS-Kae組的有益菌得分較高（圖 5C和D）。
圖4 | 服用Kae可增加DSS處理后小鼠的腸道微生物群的多樣性和豐富度
圖5 | 山奈酚對(duì)腸道菌群分布的影響
4.山奈酚Kae 對(duì)腸道微生物群相關(guān)代謝物起到調(diào)節(jié)作用
使用GC-MS非靶向代謝組學(xué)研究 Kae 補(bǔ)充劑對(duì)結(jié)腸炎小鼠糞便代謝特征的影響。PLS-DA 和 OPLS-DA分析顯示，DSS和DSS-Kae 組小鼠的代謝特征明顯不同（圖6A和B），鑒定出14種在DSS 和DSS-Kae組之間豐度差異顯著的代謝物。服用Kae 可大大增加 DSS 處理的小鼠 D-果糖 2,6-二磷酸、D-木糖、半乳糖醇、乳糖和 N-乙酰-5-羥色胺的表達(dá)水平（圖6C）。
通路富集分析表明，Kae 引起了與苯丙氨酸代謝、半乳糖代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)的代謝途徑的重大改變（圖6D）。結(jié)果表明 Kae 對(duì) UC的保護(hù)作用與微生物代謝物的調(diào)節(jié)有關(guān)。
圖6?|?Kae改變了糞便代謝成分
5、山奈酚可抑制 LPS-TLR4-NF-kB 炎癥通路的表達(dá)
DSS組小鼠血清中的 LPS 含量顯著增加，表明 DSS 引發(fā)了代謝性內(nèi)毒素血癥（圖7A）。但DSS-Kae 組的LPS 水平顯著降低，表明 Kae 能夠緩解 DSS 誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥。免疫組織化學(xué)分析顯示 Kae 抑制了DSS誘導(dǎo)的 TLR4、MyD88、p-NF-kB-P65 和 NLRP3 的表達(dá)（圖7B）。因此Kae 的抗結(jié)腸炎活性可部分歸因于LPS-TLR4-NF-kBinflammatory通路的抑制。
圖7?| Kae抑制LPS-TLR4-NF-kB 信號(hào)通路
6、山奈酚的抗結(jié)腸炎作用可能是由微生物群轉(zhuǎn)移引起的
為了進(jìn)一步評(píng)估腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物在Kae的抗炎中的作用，進(jìn)行了FMT和共同住房實(shí)驗(yàn)（圖8A）。結(jié)果表明，F(xiàn)MT顯著增加了DSS-Kae小鼠和DSS小鼠的結(jié)腸長度，降低了DAI評(píng)分，并減輕了病理特征（圖 8B-F）。此外移植組血清的 IL-1b、IL-6、TNF-a 和 LPS 含量也降低（P < 0.05）（圖8G-J）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 Kae 對(duì)結(jié)腸炎的有益作用與其調(diào)節(jié)微生物群的能力有關(guān)。
圖8?| 響應(yīng) Kae 改變的微生物群移植概括了 Kae 治療對(duì) DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的影響
相關(guān)討論
很多研究表明，腸道微生物群多樣性和豐富度的下降與結(jié)腸炎患病率的增加相關(guān)，UC患者中厚壁菌門與擬桿菌門的比率 (F/B) 下降，而變形菌門的豐度顯著增加，這也是腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志性特征。作者的研究發(fā)現(xiàn)，Kae 可以逆轉(zhuǎn) DSS 治療小鼠的 F/B 比率。Kae 處理組通過降低變形菌的豐度來重塑微生物群的組成，同時(shí)一些益生菌例如 Prevotellaceae 和 Ruminococcaceae 門增加。
在消化過程中，腸道微生物群會(huì)產(chǎn)生大量代謝物。這些代謝物與腸上皮細(xì)胞相互作用，可進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并在人類健康和疾病中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)表明本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的差異代謝物半乳糖代謝與維持細(xì)胞的能量攝入有關(guān)，而苯丙氨酸、精氨酸和脯氨酸的代謝與多種人類疾病密切相關(guān)。
用 FMT作者進(jìn)一步證明了腸道菌群在調(diào)節(jié) Kae 對(duì) UC 小鼠的影響方面起著關(guān)鍵作用。腸道微生物的糞口移植的數(shù)據(jù)表明 Kae 的抗結(jié)腸炎作用可以在共同飼養(yǎng)的小鼠之間轉(zhuǎn)移，意味著腸道微生物群參與了Kae的作用機(jī)制。
微生物16S rRNA 基因的測(cè)序表明，變形菌在研究的過程中變形菌起著關(guān)鍵作用。TLR4 是變形菌釋放的LPS 的特異性受體。本研究表明Kae可通過抑制 DSS 引發(fā)的結(jié)腸炎小鼠中LPS-TLR4-NF-kB 信號(hào)傳導(dǎo)的激活來抑制炎癥相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)。
腸黏膜屏障的破壞是結(jié)腸炎原因之一，可導(dǎo)致腸道通透性升高，抗原、毒素和病原體從腔內(nèi)環(huán)境滲入黏膜組織，導(dǎo)致炎癥發(fā)作。作者發(fā)現(xiàn)與 DSS組相比，Kae-DDS組的腸道通透性降低。作者還證明 Kae 可以顯著恢復(fù)小鼠結(jié)腸炎模型中 ZO-1、occludin 和 claudin-1表達(dá)，可能恢復(fù)腸粘膜屏障的完整性。
圖9 | Kae 通過與 LPS-TLR4-NF-kB 核心途徑相關(guān)的腸道微生物群途徑發(fā)揮出色的抗UC作用
研究討論
腸道菌群失調(diào)與包括潰瘍性結(jié)腸炎UC在內(nèi)的多種病理過程有關(guān)。了解這種關(guān)系對(duì)于充分利用微生物干預(yù)在臨床治療中的治療潛力至關(guān)重要。本文發(fā)現(xiàn)Kae 通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和多種代謝物在UC小鼠中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制LPS誘導(dǎo)的 TLR4-NF-kB 信號(hào)傳導(dǎo)。該研究結(jié)果證明了Kae的抗UC作用及其潛在的治療機(jī)制，并為使用天然產(chǎn)品預(yù)防炎癥性疾病提供了新的見解。
小鹿推薦
本文是一篇非常典型的中研究藥有效成分治療疾病的機(jī)制文章，作者的實(shí)驗(yàn)分組非常合理，并通過FMF（糞便移植）和同籠實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了腸道菌群在疾病治療中發(fā)揮的重要作用。16S rRNA基因測(cè)序和GC-MS 非靶向代謝組學(xué)雙平臺(tái)的運(yùn)用，結(jié)合免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較完整地闡釋了山奈酚治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機(jī)制，對(duì)于治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了新的思路。同時(shí)，這篇文章簡單明了的實(shí)驗(yàn)思路，也可為相關(guān)研究的老師們提供參考。
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