【寫在前面】

????????今天推薦的是由意大利Nazionale Consorzio國際大學(xué)團隊在2018年10月29日發(fā)表于Autophagy?（IF：9.77JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Francesca Demarchi教授，研究表明USP1靶向ULK1并調(diào)節(jié)其細胞區(qū)室化和自噬。

【研究背景】

?????? ? USP1已被作為非小細胞肺癌治療的潛在靶點和骨肉瘤的分化治療。USP1除了在范可尼貧血的DNA修復(fù)途徑中至關(guān)重要，還通過同源重組促進雙鏈斷裂修復(fù)。除此之外，USP1還能通過對ID2的去泛素化來預(yù)防骨肉瘤細胞的分化。

????????最近研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠胚胎干細胞分化，USP1 mRNA水平降低。此外，在RAS轉(zhuǎn)化的MCF10AT乳腺細胞中，USP1蛋白在CD44+ CD24-癌癥干細胞群中富集。ULK1激酶是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。ULK1使BECN1（beclin 1）磷酸化，從而激活磷脂酰肌醇3激酶，誘發(fā)經(jīng)典的自噬通路。ULK1被CUL3泛素化（cullin3）會導(dǎo)致其被蛋白酶降解并導(dǎo)致自噬抑制。

【摘要部分】

?????????本文中作者研究了USP1是否可以通過影響ULK1去泛素化來調(diào)控自噬發(fā)生。該研究證實了先前有關(guān)ULK1泛素化的研究，并進一步闡述了USP1對ULK1的調(diào)控可能誘導(dǎo)經(jīng)典自噬通路與MAP1LC3B依賴的自噬通路的轉(zhuǎn)換。作者認為，自噬平衡朝著非經(jīng)典自噬通路轉(zhuǎn)化可能有助于殺死癌細胞。

【研究內(nèi)容】

1.??USP1調(diào)節(jié)哺乳動物細胞中ULK1的細胞區(qū)室化

????????WP1130對去泛素化酶的抑制作用會降低哺乳動物細胞提取物（Triton X-100可溶性部分）中ULK1的蛋白水平。為證實這項研究，作者使用siRNA進行USP1敲低并發(fā)現(xiàn)其與U2OS，HEK293和MCF10AT細胞的可溶部分中totalULK1和ULK1p-Ser555的減少有關(guān)。野生型USP1的過表達可回補可溶性部分中ULK1和ULK1p-Ser555的減少。作者還發(fā)現(xiàn)，AMPK對ULK1第555位Ser的磷酸化對于其在自噬中的功能至關(guān)重要。

? ? ????研究發(fā)現(xiàn)，USP1的敲低顯著降低了可溶性部分中總ULK1的蛋白水平。這可能是由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低所致。但用蛋白酶抑制劑硼替佐米對USP1缺失的U2OS和MCF10AT細胞進行處理的實驗表明，ULK1蛋白水平降低并非是因為這個原因。

? ? ????通過熒光分析作者發(fā)現(xiàn)，DUB抑制劑WP1130會誘導(dǎo)GFP-ULK1定位到聚集體樣結(jié)構(gòu)中，并在細胞裂解后處于TritonX-100不溶性沉淀中。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)ULK1聚集體在USP1下調(diào)的細胞中明顯存在。與預(yù)期一致，在沉淀部分中VIM（波形蛋白）和HDAC6（兩個聚集體的marker）含量更高。USP1的另一靶標FANCD2也有類似的分布。

? ? ????為了進一步確定USP1活性與內(nèi)源性ULK1的細胞區(qū)室化相關(guān)，在用USP1抑制劑匹莫齊德處理后，通過免疫熒光和生化分級離心分析了ULK1的分布。結(jié)果顯示，Pimozide會誘導(dǎo)內(nèi)源性ULK1在4小時后定位到聚集體。

?? ? ????作者通過免疫熒光分析和免疫沉淀實驗驗證了ULK1與泛素結(jié)合受體蛋白SQSTM1的共定位/相互作用。之前的研究表明，WIP1130處理會誘導(dǎo)形成GFP-ULK1聚集體，且內(nèi)源性ULK1與SQSTM1有部分的共定位。通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，USP1敲低的細胞中SQSTM1-ULK1的相互作用強于對照組的細胞。正如預(yù)期，與對照組相比，USP1敲低細胞的澄清裂解物中ULK1蛋白水平降低。另一方面，SQSTM1-ULK1相互作用在USP1缺失的細胞中增加。

? ? ? ? 為了探究USP1敲低時ULK1聚集體的特征，作者研究了ULK1與BECN1，HDAC6與SH3GLB1的共定位。結(jié)果顯示，在雷帕霉素處理前后，USP1敲低的細胞中ULK1與BECN1有共定位，這表明BECN1也轉(zhuǎn)移到ULK1聚集體上。不僅如此，USP1的下調(diào)與ULK1與HDAC6共定位的大量增加相關(guān)。與之相反，SH3GLB1沒有與ULK1體共定位。

研究結(jié)論：在USP1敲低的細胞中，細胞裂解物的可溶部分中的UKL水平會降低，USP1的敲低會導(dǎo)致ULK1定位到聚集體中（aggresome）。USP1的敲低與SQSTM1-ULK1共定位的增加以及裂解物沉淀（可溶于尿酸部分）中自噬蛋白的富集相關(guān)。分級分離實驗證明USP1的敲低會使ULK1定位到沉淀中。另一方面，免疫熒光實驗證明在USP1敲低的細胞中，ULK1與BECN1和HDAC6有共定位。

2.? USP1可與ULK1相互作用并使其去泛素化

????????作者已經(jīng)證明，USP1敲低會極大地影響ULK1的區(qū)室化。為了研究這種影響是直接還是間接發(fā)生的，作者通過免疫共沉淀分析研究了ULK1-USP1的相互作用。USP1底物通常與USP1輔因子WDR48相互作用。因此，將編碼MYC-WDR48的表達載體轉(zhuǎn)染到完整的HEK293細胞中，并在免疫沉淀和免疫印跡后監(jiān)測可與WDR48相互作用的蛋白。正如預(yù)期，免疫沉淀實驗證實USP1與MYC-WDR48可相互作用。

????????先前的研究證明雷帕霉素可誘導(dǎo)由TRAF6介導(dǎo)的ULK1的K63位泛素化。為了評估USP1是否與ULK1的K63位的去泛素化有關(guān)，作者分析了雷帕霉素治療前后對照組和USP1敲低細胞中ULK1的泛素化狀態(tài)。作者證實了雷帕霉素治療后K63位泛素化會增加。有趣的是，USP1敲低大大增加了ULK1的K63位的單泛素化以及多泛素化水平。

研究結(jié)論：結(jié)果表明USP1可使ULK1去泛素化。

3.? 在USP1敲低的細胞中，經(jīng)典自噬通路被抑制，而非經(jīng)典自噬通路被持續(xù)激活

????????作者已經(jīng)證明，在USP1敲低的細胞中，ULK1區(qū)室化發(fā)生了變化，其K63位的泛素化也有所增加。下一步作者希望探究USP1敲低對自噬的影響的是什么。實驗發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素誘導(dǎo)了對照細胞中自噬體的形成，但在USP1敲低的細胞中卻沒有誘導(dǎo)效果。該數(shù)據(jù)表明經(jīng)典自噬的進行需要USP1的參與，并在USP1敲低的細胞中揭示了另一種MAP1LC3B依賴的自噬通路，該通路將SQSTM1引導(dǎo)至溶酶體清除。

? ? ? ? 在對照組細胞中，雷帕霉素處理后MAP1LC3B體的數(shù)量增加。在USP1缺失的細胞中，MAP1LC3B體在未經(jīng)雷帕霉素處理的細胞中就已經(jīng)存在。值得注意的是，在對照細胞中，雷帕霉素處理后，MAP1LC3B-SQSTM1共定位增加。與之相反，在USP1敲低的細胞中，MAP1LC3B-SQSTM1在未經(jīng)雷帕霉素處理的條件下發(fā)生部分共定位。

研究結(jié)論：實驗表明，非經(jīng)典自噬在USP1敲低的細胞中被激活，而經(jīng)典自噬通路被阻礙。

4.? 靶向USP1可以幫助殺死具有自噬能力的癌細胞

????????關(guān)于乳腺癌樣品中USP1蛋白水平的分析目前還沒有文章報道。為了研究乳腺癌中的MAP1LC3B是否可能與USP1共表達，作者選擇了95個浸潤性乳腺癌樣本的試驗性樣本，通過免疫組化分析腫瘤樣品以評估USP1和MAP1LC3B蛋白。除一個樣本外，所有ERBB2/ HER2乳腺癌均為USP1陰性。盡管樣本數(shù)量很少，但當考慮整個樣本群體或僅三陰性腫瘤樣本組時，作者發(fā)現(xiàn)USP1和MAP1LC3存在著顯著相關(guān)性。這項初步的免疫組織化學(xué)研究證明，USP1和MAP1LC3B在95個乳腺癌樣品中顯著共表達。

? ? ? ? 抑制USP1的抗精神病藥物匹莫齊特先前已顯示可抑制某些乳腺癌細胞系的細胞增殖。作者研究了匹莫齊特是否可能減慢U2OS細胞的生長速度，以及此作用是否是USP1依賴性的。作者在添加匹莫齊特之前和之后對參照和USP1敲低的細胞進行計數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)在最初的24小時后，匹莫齊特誘導(dǎo)USP1依賴性的細胞生長減緩。USP1敲低本身減慢了細胞的生長速度，但匹莫齊特治療并未進一步增強這種作用。在添加匹莫齊特后48小時，細胞生長的下降不再取決于USP1。

????????為了驗證依賴匹莫齊特的生長抑制效果至少部分是由于對自噬的抑制，作者將atg13和ulk1基因敲除的MEF的細胞活力及其對匹莫齊特的反應(yīng)分別與各自的野生型對照進行了比較。在自噬受損的基因敲除的MEF中，匹莫齊特對細胞生長的抑制作用顯著降低。

研究結(jié)論：這些數(shù)據(jù)揭示了一種針對依賴自噬生存的USP1陽性腫瘤的新型潛在治療策略。

【結(jié)論與討論】

????????作者證實，ULK1的泛素化作用會嚴重影響其區(qū)室化，且USP1可以使得ULK1去泛素化。作者還證明了USP1敲低會增加雷帕霉素處理引發(fā)的ULK1依賴的TRAF6?蛋白K63位的泛素化，這表明USP1直接參與了去除ULK1第K63位連接的泛素化過程。研究還顯示，盡管自噬需要ULK1的K63位泛素化，但在USP1缺失的細胞中，經(jīng)典自噬通路被破壞。

原文鏈接：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2018.1535291

Thank you!