動物模型 | CAR-T治療相關(guān)細(xì)胞因子釋放綜合征小鼠模型的建立
CAR-T細(xì)胞療法臨床治療并發(fā)癥嚴(yán)重危害患者自身安全，如細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokinereleasestorm，CRS）和神經(jīng)不良反應(yīng)等并發(fā)癥，其中，CRS為最常見的嚴(yán)重不良反應(yīng)。CRS往往發(fā)生于患者接受 CAR-T細(xì)胞輸注數(shù)小時(shí)或數(shù)天后。目前，臨床醫(yī)師通過監(jiān)測血清中IL-6和C反應(yīng)蛋白等因子的濃度來判斷CRS 發(fā)生的可能性以及干預(yù)時(shí)機(jī)，但這種方法需要在短時(shí)間內(nèi)多次驗(yàn)血以檢測相關(guān)細(xì)胞因子濃度水平，一定程度上不僅給患者帶來極大痛苦，也增加了治療成本。
簡單的體外細(xì)胞模型難以模擬CRS的發(fā)生，更難以用于探究CRS不良反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。有研究顯示，單核細(xì)胞在CRS發(fā)生過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。因此，選擇合適的動物模型能夠模擬臨床患者發(fā)生CRS的過程，為后續(xù)探究影響CRS 發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
動物的選擇
Ｔ細(xì)胞、Ｂ細(xì)胞和ＮK細(xì)胞缺失但單核細(xì)胞發(fā)育正常的重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID/Beige）小鼠適合用于CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)CRS研究的動物模型。
造模方法
CAR-T細(xì)胞制備：收集健康人群來源的外周血，密度梯度離心法收集外周血單核細(xì)胞后，磁珠分選獲得CD3＋T細(xì)胞，加入CD3和D28免疫磁珠刺激活化CD3＋T細(xì)胞。將包裝好的病毒顆粒按照感染復(fù)數(shù)為５感染活化后的CD3＋T細(xì)胞。感染３ｄ后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CAR-T細(xì)胞陽性率。
CAR-T細(xì)胞功能檢測：將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）?組、UTD-D組和CAR-T19組細(xì)胞與CD19陽性腫瘤細(xì)胞（Nalm-6和Raji）或CD19陰性腫瘤細(xì)胞（K562）按不同的效靶比（分別為0:1、1:1、5:1、10:1、20:1）共孵育，流式細(xì)胞術(shù)雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，ELISA分析各組的細(xì)胞因子分泌情況（效靶比為20:1）。
ELISA試劑盒檢測小鼠細(xì)胞因子分泌：取小鼠血清，96孔板中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣品，室溫于振蕩混勻儀（200rpm）孵育21h，洗板３次后每孔加入100μl 1×檢測抗體，繼續(xù)室溫于振蕩混勻儀（200rpm）孵育1h，完成孵育后，每孔加入100μl 1×Avidin-HRP振蕩混勻儀（200rpm）孵育30min加入3，3′，5，5′?四甲基聯(lián)苯胺室溫避光顯色10min，加入終止液終止顯色反應(yīng)（顏色由藍(lán)變黃）后立即采用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處吸光度（A）值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及A值于Excel中描述標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品A值計(jì)算樣品細(xì)胞因子濃度。
非抗原特異性Ｔ細(xì)胞在SCID/Beige小鼠中誘發(fā)CRS：６～８周齡雌性 SCID/Beige 小鼠６只，分為２組，每組３只。一組經(jīng)尾靜脈注射人Ｔ細(xì)胞（Ｔ細(xì)胞組），另外一組經(jīng)尾靜脈注射人Ｔ細(xì)胞和Ｔ細(xì)胞活化抗體（OKT-3抗體，Ｔ細(xì)胞＋OKT-3抗組），檢測小鼠的體溫、體重和行為活動。注射后0、3、6、12、24 和 36ｈ于小鼠尾靜脈取血，ELISA 試劑盒檢測小鼠血清細(xì)胞因子水平的變化。
Raji-Luc2 皮下移植瘤模型的建立及分組：6～8周齡雌性SCID/Beige小鼠９只，分為３組，每組３只。第０天分別通過尾靜脈注射PBS、1×100000個(gè)和5×100000個(gè)Raji-Luc2細(xì)胞，分別記為PBS組、低負(fù)荷組和高負(fù)荷組，確認(rèn)成瘤7d后，經(jīng)尾靜脈注射2×10000000個(gè)CAR-T19細(xì)胞。
CAR-T19細(xì)胞引發(fā)小鼠CRS：注射CAR-T19后，間隔6h測量小鼠體重及體溫的變化，同時(shí)尾尖采血，收集在肝素鈉預(yù)處理的離心管中，離心半徑8cm，2000r/min離心10min，收集血漿，依據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中CRS相關(guān)細(xì)胞因子人IL-2、人γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、鼠IL-6、人IL-15、鼠粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子（ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）水平的變化。
Raji-Luc2細(xì)胞移植瘤生物發(fā)光區(qū)域及其強(qiáng)度的測量：采用成像系統(tǒng)對SCID/Beige小鼠進(jìn)行生物發(fā)光成像，運(yùn)用活體圖像軟件對Raji-Luc2細(xì)胞移植瘤發(fā)光區(qū)域及強(qiáng)度進(jìn)行分析，計(jì)算絕對光子數(shù)。
結(jié)果
CAR-T細(xì)胞構(gòu)建：含4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CD19特異性CAR結(jié)構(gòu)（CAR-T１９）由 CD19抗體的單鏈可變區(qū)、CD8跨膜區(qū)、4-1BB胞內(nèi)區(qū)以及CD3胞內(nèi)區(qū)組成。慢病毒載體感染后，人CD3+T細(xì)胞中CAR陽性率＞30％。
CAR-T19細(xì)胞特異性識別 CD19分子：分別將PBS組、UTD-T組和CAR-T19組細(xì)胞與CD19陽性腫瘤細(xì)胞（Nalm-6 和Raji）或 CD19陰性腫瘤細(xì)胞（K562）共孵育，結(jié)果顯示，CAR-T19細(xì)胞能夠有效靶向 CD19分子并發(fā)揮殺傷作用ELISA結(jié)果顯示，在CD19抗原存在時(shí)，CAR-T19細(xì)胞與Raji、Nalm-6 共孵育組細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平均高于K562共孵育組。??? PBS組T細(xì)胞或CAR-T細(xì)胞在無CD19抗原存在時(shí)，均未顯示出殺傷活性和細(xì)胞因子分泌。表明CAR-T19能夠特異性識別CD19分子，并成功分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2，從而發(fā)揮殺傷作用。
CAR-T19細(xì)胞對Raji腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：PBS組、低負(fù)荷組和高負(fù)荷組小鼠成瘤后，第7天經(jīng)尾靜脈回輸活化后的CAR-T19細(xì)胞。在接種腫瘤細(xì)胞的第13天，小鼠成像實(shí)驗(yàn)顯示，低負(fù)荷和高負(fù)荷組小鼠腫瘤熒光強(qiáng)度均低于接種腫瘤的第7天，高負(fù)荷組腫瘤熒光強(qiáng)度降低約97%，低負(fù)荷組腫瘤熒光強(qiáng)度降低約95%。表明 CAR-T19回輸后，CAR-T19細(xì)胞在體內(nèi)能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。
CAR-T19細(xì)胞殺傷Raji 腫瘤細(xì)胞誘發(fā)小鼠體內(nèi)CRS發(fā)生：荷瘤小鼠注射 CAR-T19細(xì)胞72h后，血清中T細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-15、IFN-γ水平迅速增高，單核細(xì)胞相關(guān)因子IL-16、GM-CSF分泌增加，同時(shí)伴隨有體溫升高和體重降低等CRS典型特征。小鼠肝、腎、肺組織病理切片HE染色結(jié)果顯示，低負(fù)荷組、高負(fù)荷組小鼠肝、腎、肺組織無明顯損傷。說明CAR-T19胞自身不會引起小鼠CRS，而在接種了高劑量或低劑量Raji細(xì)胞的小鼠中，CAR-T19細(xì)胞均引起小鼠CRS。
