質譜流式技術（Mass Cytometry）在藥物開發(fā)和生物藥物表征中的潛力巨大。質譜流式細胞術將質譜技術與流式細胞儀相結合，能夠實現(xiàn)對單個細胞的生化成分進行深入研究，幫助我們理解疾病機制，驗證藥物的效果，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點以及增強生物制藥質量控制。這在生物藥物表征中非常有用，它可以幫助解決以下一些問題：

單細胞層次的分子表征：傳統(tǒng)的質譜技術通常需要大量的樣本以獲取可靠的結果，而質譜流式技術則可以分析單個細胞的生化成分，這可以幫助我們更深入地理解細胞的生物學特性。?

生物分子的定量分析：質譜流式技術可以對細胞內的生物分子進行定量分析，包括蛋白質、代謝物和其他生物分子。?

細胞異質性的研究：細胞群體中的細胞并非完全相同，它們之間的差異可能影響疾病的發(fā)展和治療的效果。質譜流式技術可以幫助我們研究這種細胞異質性。?

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細胞質譜分析，該平臺能夠完成包括單細胞捕獲、cDNA合成、實時定量PCR分析、目標區(qū)域擴增以及質譜流式細胞分析。

質譜流式分析可分為五個主要過程：樣品引入和電離、離子通過真空錐體接口、離子篩選、飛行時間（TOF）質量分析、數(shù)據(jù)的采集和處理。

1、樣品引入和電離?

質譜流式樣本制備完畢后以細胞懸液的狀態(tài)進入儀器，通過霧化器（Nebulizer）被分成小液滴，每個液滴包含一個細胞。包含細胞的液滴隨后進入霧化室（Spray chamber），高溫使氣溶膠部分氣化并引向ICP源。整套過程使用氬氣來進行提供氣體環(huán)境與壓力（圖2）。

在細胞懸液霧化階段，需要使用被稱為霧化器（Nebulizer）的裝置。霧化器包括一個攜帶液體樣品的內部毛細管和一個攜帶氬氣的外室。氬氣以大約0.15-0.25 L/min的速度在外室流動，毛細管內的樣品在大氣壓力下移動，當樣品從尖端流出時，霧化器氣體對液體施加的剪切力將其分解成細小的氣溶膠液滴進入霧化室（圖3）。

霧化室（Spray chamber）外部設有加入裝置，其溫度可達到200 ?C，在霧化室中高流量的加熱氬氣將氣溶膠液滴部分蒸發(fā)，縮小其尺寸，以便進入等離子體炬被離子化（圖4）。

等離子體炬（Torch）由三個同心室組成：矩管，兩個同心石英管融合組件以及一個石英樣品注入管。最外側的腔室中的氬氣流量為18 L/min，被點燃后形成等離子體。中央室的氬氣流量約為1 L/min，用于改變等離子體底部相對于樣品注入管的位置。最內側的腔室將氬氣流和樣品氣溶膠傳送到等離子體的中心。全部組件安裝在一個電感線圈內，該線圈的電流是由射頻（Radio frequency，RF）產(chǎn)生的，這種電流產(chǎn)生了維持等離子體的電磁場。

在負載線圈產(chǎn)生的電磁場內的等離子體是通過氬氣的電離而形成。首先，氬氣從炬管的外腔切向流動，提供給負載線圈的射頻電流在氬氣離開外腔時產(chǎn)生了一個強大的電磁場，高壓電火花將電子從氬原子中剝離出來。這些自由電子在電磁場中加速，并以足夠的能量碰撞，使氬氣發(fā)生電離。當氣溶膠樣品通過樣品注入管被引入等離子體時，水滴被迅速汽化，單個細胞隨后被汽化，形成原子云，然后被電離（圖5）。

質譜流式樣品的引入和電離體系均使用氬氣。為什么要用氬氣（Ar）？首先氬氣是惰性氣體，并且具有相對便宜，易獲得高純度氣體的優(yōu)點。更重要的是Ar 的第一電離能是15.75電子伏特 (eV)，高于大多數(shù)元素的第一電離能 (除了He, F, Ne)，低于大多數(shù)元素的第二電離能 (除了Ca, Sr, Ba,etc)，等離子體的電離環(huán)境由氬氣組成, 大多數(shù)元素可以被有效地電離為單電荷離子。

2、離子通過真空錐體接口?

在大氣壓力（760 Torr）下產(chǎn)生的等離子體通過真空錐體接口（圖6）。真空錐體接口的目的是將離子從大氣壓力下的等離子體有效地輸送到容納離子光學器件的腔室中，其壓力小于10-3 Torr。Helios使用3個錐體接口將等離子體輸送到低壓真空中：取樣器（直徑1.1 mm的孔口）、撇渣器（直徑1 mm的孔口）和減壓器（直徑1.2 mm的孔口）。所有3個錐體都是由鎳制成的，接口外殼是水冷的，以減弱等離子體產(chǎn)生的熱量。3個錐體可以減少等離子體的壓力并將離子聚攏到下游的離子光學器件。

3、離子篩選?

離開真空接口的離子云含有低質量的離子，它們不具有分析意義，而且豐度很高，易會損壞檢測器。四級桿由四根帶有直流電壓（Direct current，DC）和射頻電壓（RF）的平行桿構成，相對的一對電極是等電位的，兩對電極之間電位相反。當一組質荷比不同的離子進入由直流電壓和射頻電壓組成的電場時，只有滿足特定條件的離子作穩(wěn)定振蕩通過四極桿。質譜流式的離子篩選系統(tǒng)從離子束中去除不需要的低質量的氬和其他離子，一個只包含高質量同位素的離子流（>75 amu）被引導通過這個通道，進入飛行時間質譜（圖7）。

4、飛行時間（TOF）質量分析?

從離子光學系統(tǒng)出來的離子云被送到飛行時間（TOF）質量分析儀中，它根據(jù)質量電荷比（m/z）分離離子。離子進入TOF分析器的加速器后，以13 μs的間隔（頻率為76.8 kHz），數(shù)百伏的脈沖將累積的離子正交加速到反射器上，反射器將離子重新定向到檢測器上。無論離子初始位置或能量如何，通過加速器和反射器中的電場配置，都能將離子聚焦到緊密的時間分辨帶（圖8）。

離子飛向檢測器的時間與它們的質荷比（m/z）之間的關系是：

其中t0和A是從質量校準程序中得出的。ICP使金屬原子電離主要變成單一的正電荷狀態(tài)。每一團離子云都被分解成一系列的帶，最輕的同位素探針首先到達檢測器，而每個連續(xù)的較重質量的同位素在稍后的時間到達檢測器。每個質量為M的離子的飛行時間分辨帶與其質量為M±1的離子相隔20-25 ns。在第一組離子被推出并被檢測到后，第二個脈沖將下一組離子推出來進行檢測，循環(huán)往復直到數(shù)據(jù)采集完成。

在TOF中分離的離子用一個動態(tài)電子倍增器來檢測。當一個離子撞擊檢測器的第一個動態(tài)節(jié)點時，幾個二次電子被釋放出來。這些電子撞擊下一個動態(tài)節(jié)點，在那里產(chǎn)生更多的電子。這個過程在每個動態(tài)節(jié)點上重復，形成一個電子脈沖，被探測器的陽極捕獲。輸出的模擬信號被放大并由一個雙8位數(shù)字轉換器轉換為數(shù)字值。8位數(shù)字轉換器以1 ns的采樣間隔進行數(shù)據(jù)轉換。

5、數(shù)據(jù)的采集和處理?

質譜流式系統(tǒng)使用TOF解析多元素樣品，每個同位素的離子在離散的20-25 ns的時間窗口到達檢測器，這取決于它們的質荷比。在非常低的離子濃度下，脈沖信號重疊的概率可以忽略不計，通過簡單地計算脈沖的數(shù)量（Counts）可以最精確地確定離子計數(shù)（圖9左）。隨著離子濃度的增加，離子脈沖開始在同一時間到達檢測器。在這種情況下，脈沖數(shù)低估了真正的離子數(shù)，而強度（Intensity）成為更準確的測量（圖9右）。

質譜流式收集的數(shù)據(jù)范圍要求收集雙重數(shù)據(jù)，這意味著每個通道都要收集脈沖計數(shù)（Pulse count）和強度值（Intensity）。CyTOF軟件將整個數(shù)據(jù)范圍繪制在一個單一的雙信號刻度上，其單位是擊中檢測器的粒子的實際計數(shù)。為了實現(xiàn)這一點，需要做兩件事。首先，應用一個雙計數(shù)系數(shù)，根據(jù)以下公式將模擬強度轉換為實際計數(shù)。

第二，應用一個雙轉換閾值，低于這個閾值時使用脈沖計數(shù)，高于這個閾值時使用系數(shù)轉換的模擬強度的計數(shù)。使用雙計數(shù)系統(tǒng)，質譜流式可以在廣泛的信號輸入范圍內對每個細胞的結合抗體標簽進行量化。數(shù)據(jù)被保存為文本（.txt）和流式細胞儀標準（.fcs）3.0格式，以便在兼容的軟件中進行數(shù)據(jù)分析。