背景

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性發(fā)病率最高的腫瘤疾病。CRISPR技術(shù)作為一種簡單、高效、精確的基因編輯手段，不僅可用于檢測藥物靶點及耐藥靶點，為靶向藥篩選提供便捷，還能用于基因治療，有助于科研人員對治療及逆轉(zhuǎn)治療后的耐藥進行研究。截止現(xiàn)在，已有較多報道闡述了利用CRISPR技術(shù)乳腺癌方面的研究成果。以下盤點一些利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究乳腺癌的案例，希望能給您的研究帶來一些幫助。

PP2A-B55抑制激酶MASTL/Greatwall在乳腺癌中的治療意義

B55家族基因中的PP2A調(diào)節(jié)亞基的缺失或表觀沉默是乳腺癌細(xì)胞的一個共同點，失活的腫瘤抑制子PP2A經(jīng)常在人類的腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。而細(xì)胞周期激酶MASTL（也叫Greatwall）是PP2A-B55磷酸酶復(fù)合物調(diào)控的關(guān)鍵因子——在細(xì)胞分裂過程中，維持有絲分裂狀態(tài)需要MASTL抑制PP2A-B55，而有絲分裂結(jié)束則需要MASTL失活并使PP2A再激活。MASTL作為人類癌癥治療的靶點，為進一步了解其治療相關(guān)性及其對PP2A活性依賴性，西班牙的細(xì)胞分裂與乳腺癌研究中心聯(lián)合英國劍橋癌癥研究中心等其他研究團隊，用RNA干擾或利用CRISPR/Cas9技術(shù)對MASTL基因進行敲降或敲除，發(fā)現(xiàn)?MDA-MB-231等一些乳腺癌細(xì)胞株的增殖受損。由于敏感的癌細(xì)胞需要MASTL激酶活性和PP2A的B55亞基表達，這表明有部分乳腺癌患者可以從MASTL定向治療中受益。此外，MASTL蛋白水平升高與疾病預(yù)后不良相關(guān)，并可能在雌激素受體（ER）陽性乳腺腫瘤中具有獨立于Ki67增殖標(biāo)志物的預(yù)后價值。

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Linc-RoR促進MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和雌激素獨立的乳腺癌生長

ER+乳腺癌細(xì)胞從雌激素依賴狀態(tài)向雌激素獨立狀態(tài)的轉(zhuǎn)化是促進內(nèi)分泌治療耐藥性的關(guān)鍵步驟。為了研究MAPK/ERK信號通路在雌激素獨立乳腺癌細(xì)胞生長中的潛在機制，江蘇大學(xué)團隊從lncRNA數(shù)據(jù)庫中選擇了一組重點的lncRNA，并對其表達進行了分析。采用CRISPR/Cas9對MCF-7細(xì)胞進行l(wèi)inc-RoR敲除，通過回補實驗在敲除細(xì)胞中重新表達linc-RoR。群落形成和MTT測定檢測了linc-RoR在雌激素獨立的生長和他莫西芬耐藥中的作用。使用Western blot和qRT-PCR分別檢測蛋白和lncRNA水平的變化。使用Kaplan-Meier?Plotter (http://kmplot.com)數(shù)據(jù)集分析了與DUSP7相關(guān)的臨床結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)linc-RoR作為一種onco- lncRNA，促進了ER+乳腺癌的雌激素獨立性生長。且在雌激素剝奪條件下，linc-RoR引起磷酸化的MAPK/ERK通路上調(diào)，進而激活ER信號通路。敲除linc-RoR可消除雌激素剝奪誘導(dǎo)的ERK激活和ER磷酸化，而linc-RoR的重新表達可恢復(fù)上述表型。此外，還發(fā)現(xiàn)ERK特異性磷酸酶雙特異性磷酸酶7 (DUSP7)，也被稱為MKP-X，參與了linc-RoR敲除誘導(dǎo)的MAPK/ERK信號的抑制。有趣的是，linc-RoR敲除增加了DUSP7蛋白的穩(wěn)定性，抑制ERK的磷酸化。而從臨床數(shù)據(jù)分析顯示，DUSP7在ER+乳腺癌樣本中的表達低于ER-乳腺癌樣本。此外，DUSP7表達的下調(diào)與患者生存不良相關(guān)。綜上所述，這些結(jié)果表明linc-RoR通過調(diào)節(jié)ERK特異性磷酸酶DUSP7，促進乳腺癌細(xì)胞的雌激素獨立性生長和MAPK/ERK通路的激活。因此，該研究不僅有助于研究linc-RoR在ER+乳腺癌中雌激素獨立和他莫昔芬耐藥的作用，還揭示了linc-RoR與MAPK/ERK通路之間的聯(lián)系。

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酸擠壓離子轉(zhuǎn)運體在乳腺癌細(xì)胞三維微環(huán)境生長調(diào)控中的作用

在乳腺癌的三維微環(huán)境中，通過顯著改變內(nèi)環(huán)境pH，可導(dǎo)致代謝酸生成的增加，以及細(xì)胞擴散程度降低（表現(xiàn)為細(xì)胞外空間受限），但目前對特定pH調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運體對乳腺癌3D生長的作用仍然知之甚少。哥本哈根大學(xué)Pedersen教授對MCF-7和MDA-MB-231進行相關(guān)蛋白的Western blot(2D和3D生長)、免疫組化定量分析和球形生長實驗，并通過藥理作用、shRNA/siRNA介導(dǎo)的敲低以及CRISPR/Cas9敲除三種途徑來評估單個轉(zhuǎn)運蛋白的作用。在MCF-7細(xì)胞球體中，乳酸-H+共轉(zhuǎn)運蛋白MCT1 (SLC16A1)的表達從球體外周向球心增加，Na+、HCO3?共轉(zhuǎn)運蛋白NBCn1 (SLC4A7)在球體外周高度表達，Na+/H+交換蛋白NHE1 (SLC9A1)和MCT4 (SLC16A3)分布均勻。MDA-MB-231細(xì)胞球體中也出現(xiàn)了類似的模式，但這些細(xì)胞不表達MCT1。3D培養(yǎng)時NBCn1和NHE1的相對總表達量較2D培養(yǎng)時降低，MCT1和MCT4的相對總表達量未發(fā)生改變。MCT1 (AR-C155858)的抑制作用減弱了MCF-7的球體的生長，加入S0859 (Na+、HCO3?共轉(zhuǎn)運蛋白和MCTs的抑制劑)會加劇了這一現(xiàn)象。藥理數(shù)據(jù)通過穩(wěn)定敲低MCT1或NBCn1來重現(xiàn)，而敲低MCT4則沒有影響。使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除NHE1，但NHE1部分敲除和NHE1抑制劑cariporide都沒有抑制MCF-7球體生長。相反，MDA-MB-231球體的生長受到了NHE1敲低和NHE1敲除的抑制，而并非NBCn1或MCT4敲低。這項研究展現(xiàn)了四種主要的酸擠壓轉(zhuǎn)運蛋白在人乳腺癌細(xì)胞的三維球體中不同的表達和定位模式，并揭示了三維的生長以細(xì)胞類型依賴的方式依賴于這些轉(zhuǎn)運蛋白，這對乳腺癌治療具有潛在的重要意義。

源井生物基于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)進一步研發(fā)了CRISPR-U?獨家專利技術(shù)，具有更高的基因編輯效率，目前源井生物已憑借該技術(shù)成功構(gòu)建了擁有超3000種KO細(xì)胞的基因敲除細(xì)胞庫，現(xiàn)一周內(nèi)即可獲得成功敲除的KO細(xì)胞，輕松滿足各類研究。