近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院張建軍研究員、陳萬濤教授為共同通訊作者，在 Molecular Therapy?(IF:?11.454) 期刊發(fā)表了題為“Long noncoding RNA lnc-POP1-1 upregulated by VN1R5 promotes cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma through interaction with MCM5”的研究論文，報(bào)道了長鏈非編碼 RNA lnc-POP1-1 在頭頸鱗癌順鉑耐藥中的作用及調(diào)控機(jī)制。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院蔣英英博士后和郭海艷醫(yī)師為共同第一作者。文章中表達(dá)譜芯片、標(biāo)記定量蛋白組 iTRAQ、蛋白質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)均由歐易生物協(xié)助完成。

?研究背景?

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一。由于其高局部復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后，HNSCC 嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量。目前 HNSCC 主要治療手段包括手術(shù)、放療和化療。其中順鉑是 HNSCC 化療治療的核心藥物，但部分中容易出現(xiàn)順鉑獲得性耐藥性，導(dǎo)致 HNSCC 治療失敗。因此，研究導(dǎo)致順鉑耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因素，探索順鉑耐藥的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效的治療方法，提高 HNSCC 療法的臨床療效具有重要意義。

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?研究內(nèi)容?

本研究通過標(biāo)記定量蛋白組 iTRAQ 鑒定到一個(gè)與順鉑耐藥相關(guān)的蛋白 VN1R5，它在順鉑耐藥的 HNSCC 細(xì)胞和組織中高表達(dá)。通過表達(dá)譜芯片的篩選，發(fā)現(xiàn) lncRNA lnc-POP1-1 是 VN1R5 的下游靶標(biāo)。進(jìn)一步研究證實(shí)，VN1R5 通過 cAMP/PKA 途徑激活轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控 lnc-POP1-1 的表達(dá)。VN1R5 以 lnc-POP1-1 依賴的方式促進(jìn) HNSCC 細(xì)胞的順鉑耐藥性：lnc-POP1-1 與 MCM5 蛋白結(jié)合，通過抑制 MCM5 的泛素化直接減緩了其降解，而 MCM5 蛋白促進(jìn)了順鉑引起的 DNA 損傷的修復(fù)。

?研究結(jié)果?

1.?VN1R5 促進(jìn)了 HNSCC 細(xì)胞獲得順鉑耐藥性

針對(duì)順鉑耐藥和順鉑敏感的 HNSCC 細(xì)胞系，利用標(biāo)記定量蛋白組 iTRAQ 進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選，結(jié)果顯示 VN1R5 在順鉑耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，并通過 qRT-PCR 和 Western blotting 得以證實(shí)（圖 A-C）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，VN1R5 在順鉑耐藥組織中高表達(dá)；且 VN1R5 高表達(dá)組 5 年生存率明顯低于低表達(dá)組（圖 D,E）。

在順鉑耐藥細(xì)胞系中，VN1R5 敲除顯著降低了對(duì)順鉑耐受的劑量（圖 F），而 VN1R5 過表達(dá)顯著提高了對(duì)順鉑耐受的劑量（圖 G）；利用順鉑治療，與對(duì)照相比，VN1R5 敲除裸鼠皮下移植瘤的大小和重量明顯下降（圖 H-I），而過表達(dá) VN1R5 裸鼠腫瘤的大小和重量明顯升高（圖 J-K）。以上結(jié)果表明 VN1R5 促進(jìn)了 HNSCC 細(xì)胞獲得順鉑耐藥性。

圖 1 |?VN1R5?上調(diào)表達(dá)與 HNSCC?細(xì)胞順鉑耐藥相關(guān)

2.?Lnc-POP1-1?被 VN1R5 所上調(diào)并促進(jìn) HNSCC?細(xì)胞獲得順鉑耐藥性

為了篩選 VN1R5 所調(diào)控的下游基因，利用表達(dá)譜芯片對(duì) VN1R5 敲除或過表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示篩選到一個(gè) lncRNA lnc-POP1-1（圖 A, B）。

RT-PCR 顯示，HNSCC 細(xì)胞和組織中 lnc-POP1-1 與 VN1R5 表達(dá)存在正相關(guān)，且 lnc-POP1-1 在 HNSCC 順鉑耐藥細(xì)胞、組織中亦高表達(dá)（圖 C-G）。亞細(xì)胞定位顯示 lnc-POP1-1 主要分布于頭頸鱗癌細(xì)胞核中（見附圖）。

在順鉑耐藥細(xì)胞系中，lnc-POP1-1 下調(diào)顯著降低了對(duì)順鉑耐受的劑量（圖 H）；利用順鉑治療，與對(duì)照相比，lnc-POP1-1 下調(diào)導(dǎo)致裸鼠腫瘤的大小和重量明顯抑制（圖 I-J）。反之，在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中過表達(dá) lnc-POP1-1，得到相反的結(jié)果（圖 K-M）。以上結(jié)果表明，lnc-POP1-1 能夠促進(jìn) HNSCC 細(xì)胞的順鉑耐藥性。

圖 2 |?lnc-POP1-1 表達(dá)受 VN1R5?上調(diào)并與 HNSCC?細(xì)胞順鉑耐藥相關(guān)

3.?lnc-POP1-1 介導(dǎo) VN1R5 對(duì) HNSCC?細(xì)胞順鉑耐藥性的促進(jìn)作用

在順鉑耐藥細(xì)胞系中，敲除 VN1R5 或敲低 lnc-POP1-1 均可引起細(xì)胞凋亡的顯著增加。在順鉑敏感的細(xì)胞系中，lnc-POP1-1 下調(diào)可以顯著抑制 VN1R5 對(duì) HNSCC 細(xì)胞的順鉑耐藥性（圖 A），而過表達(dá) lnc-POP1-1 可以部分逆轉(zhuǎn) VN1R5 敲除引起的 HNSCC 細(xì)胞順鉑耐藥性（圖 B）。在過表達(dá) VN1R5 的 HNSCC 細(xì)胞中敲低 lnc-POP1-1 可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖 C-D），在裸鼠皮下移植瘤模型中 lnc-POP1-1 下調(diào)可以抑制 VN1R5 過表達(dá)引起的腫瘤大小和重量的升高（圖 E-F），lnc-POP1-1 過表達(dá)可以抑制 VN1R5 敲除引起的腫瘤大小和重量的下降（圖 G-H）。

圖 3 |?lnc-POP1-1 受 VN1R5?調(diào)控影響 HNSCC?細(xì)胞的順鉑耐藥性

4.?VN1R5 通過激活轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控?lnc-POP1-1 的表達(dá)

利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測數(shù)據(jù)庫 AliBaba 和 JASPAR 來預(yù)測 lnc-POP1-1 啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，敲降 Sp1 可以逆轉(zhuǎn) VN1R5 過表達(dá)所引起的 lnc-POP1-1 表達(dá)上調(diào)；反之，過表達(dá) Sp1 可以逆轉(zhuǎn) VN1R5 敲除所引起的 lnc-POP1-1 表達(dá)下調(diào)（圖 A-D）。

ChIP-PCR 結(jié)果顯示，Sp1 主要結(jié)合到 lnc-POP1-1 啟動(dòng)子的 -2000/-1801 片段（圖 E-G），并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)（圖 H-J）。

已有研究表明 Sp1 表達(dá)受到多個(gè)信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)經(jīng) PKA 通路抑制劑 H-89 處理、過表達(dá)或敲低 PKA可以引起 HNSCC 細(xì)胞中 lnc-POP1-1 表達(dá)的改變（見附圖）。

以上結(jié)果表明 VN1R5 可以通過 cAMP/PKA 途徑調(diào)節(jié) Sp1 的轉(zhuǎn)錄活性以影響 lnc-POP1-1 的表達(dá)。

圖 4 |?VN1R5 通過調(diào)節(jié) Sp1 啟動(dòng)子活性來調(diào)控 lnc-POP1-1 表達(dá)

5.?lnc-POP1-1 促進(jìn) DNA?損傷修復(fù)且與 MCM5 結(jié)合

為進(jìn)一步研究 lnc-POP1-1 參與順鉑耐藥的作用機(jī)制，利用 RNA pull-down 結(jié)合蛋白質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示與 lnc-POP1-1 結(jié)合的蛋白主要參與了 DNA 修復(fù)通路。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在 HNSCC 順鉑耐藥細(xì)胞中，DNA 修復(fù)通路是活化的。

通過數(shù)據(jù)庫篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) lnc-POP1-1 可能與蛋白 MCM5 結(jié)合，western blot、RIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩者之間的結(jié)合（圖 A-C）。與 lnc-POP1-1 一樣，MCM5 也主要分布于細(xì)胞核中（圖 D）。PRIdictor 預(yù)測 lnc-POP1-1與 MCM5 的可能結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) MCM5 第 724 位氨基酸、lnc-POP1-1 第 600-609 位核苷酸可能是兩者結(jié)合位點(diǎn)（圖 E-F）。Lnc-POP1-1 過表達(dá)可以上調(diào) MCM5 表達(dá)并抑制細(xì)胞的 DNA 損傷，且兩者結(jié)合影響細(xì)胞順鉑耐藥性（圖 G-J）。

以上結(jié)果表明，lnc-POP1-1 能夠與MCM5 結(jié)合并參與 DNA 損傷修復(fù)。

圖 5 |?lnc-POP1-1 與 MCM5 結(jié)合并參與 DNA 修復(fù)過程

6.?lnc-POP1-1 通過降低 MCM5 的泛素化以抑制 MCM5?通過蛋白酶體途徑的降解

利用蛋白質(zhì)合成抑制劑 CHX 和（/或）蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 HNSCC 細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，MG132 處理后 MCM5 蛋白更穩(wěn)定（圖 A），表明 MCM5 的降解部分通過蛋白酶體途徑；另外，過表達(dá) lnc-POP1-1 可以減緩 MCM5 的降解（圖 B）。進(jìn)一步結(jié)果顯示 lnc-POP1-1 有助于 MCM5 在細(xì)胞核內(nèi)的滯留（圖 C-D）。同時(shí)免疫沉淀結(jié)果顯示，lnc-POP1-1 敲減細(xì)胞中 MCM5 蛋白泛素化水平升高，而 lnc-POP1-1 過表達(dá)的細(xì)胞中 MCM5 蛋白泛素化水平下降（圖 E-F）。

圖 6 |?lnc-POP1-1 與 MCM5 結(jié)合以抑制 MCM5?的泛素化降解

7.?lnc-POP1-1 通過與 MCM5?相互作用影響 HNSCC?細(xì)胞順鉑耐藥性

MCM5 過表達(dá)能夠增強(qiáng) HNSCC 細(xì)胞的順鉑耐藥性（圖 A），而 MCM5 敲低能夠降低細(xì)胞的順鉑耐藥性（圖 B）。另外，lnc-POP1-1 下調(diào)能夠顯著阻斷由 MCM5 引起的順鉑耐藥性（圖 C），也可以明顯促進(jìn)由 MCM5 敲減引起的順鉑敏感性（圖 D）。

同樣，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，敲低 lnc-POP1-1 可以逆轉(zhuǎn)裸鼠由 MCM5 過表達(dá)引起的腫瘤大小和重量的增加（圖 E-F）；另外，lnc-POP1-1 下調(diào)可以加重裸鼠由 MCM5 敲減引起的腫瘤大小和重量的降低（圖 G-H）。

圖 7 |?lnc-POP1-1 通過與 MCM5?相互作用影響 HNSCC?細(xì)胞順鉑耐藥性

?研究結(jié)論?

本研究揭示了頭頸鱗癌中順鉑耐藥新的分子機(jī)制：VN1R5 通過 cAMP/PKA 信號(hào)通路促進(jìn) 轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 的轉(zhuǎn)錄活性而上調(diào) lnc-POP1-1 的表達(dá)；lnc-POP1-1 與 DNA 修復(fù)蛋白 MCM5 結(jié)合并減緩其泛素化降解，以參與 DNA 修復(fù)途徑，從而促進(jìn)了 HNSCC 細(xì)胞對(duì)順鉑的抗性。VN1R5 和 lnc-POP1-1 有望成為順鉑耐藥性的預(yù)測標(biāo)志物和逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

?參考文獻(xiàn)?

Jiang Y, Guo H, Tong T,?et al.?Long noncoding RNA lnc-POP1-1 upregulated by VN1R5 promotes cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma through interaction with MCM5.?Molecular Therapy?2021; doi: 10.1016/j.ymthe.2021.06.006.