骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡有關(guān)的代謝疾病，與骨密度有直接關(guān)系，GSTP1是一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1，其在多種疾病中的治療潛力已被發(fā)現(xiàn)。該研究通過孟德爾隨機(jī)化遺傳關(guān)聯(lián)及單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)GSTP1可能與骨密度存在一定的關(guān)聯(lián)性。通過氧化還原質(zhì)譜、免疫共沉淀、非變性非還原免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜分析、CRISPR-CAS9基因編輯等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)探究GSTP1對(duì)骨密度影響的具體機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GSTP1可以通過Pik3r1的Cys498和Cys670上調(diào)S-谷胱甘肽化水平，從而抑制其磷酸化，進(jìn)而通過Pik3r1-AKT-mTOR軸調(diào)控自噬通量的變化，影響體外破骨細(xì)胞的分化，最后在體外調(diào)控破骨細(xì)胞的形成。

浙江大學(xué)附屬醫(yī)院骨科研究中心嚴(yán)世貴課題組在氧化還原領(lǐng)域權(quán)威期刊，中科院一區(qū)TOP雜志《REDOX BIOLOGY》上發(fā)表了題為“GSTP1-mediated S-glutathionylation of Pik3r1 is a redox hub that inhibits osteoclastogenesis through regulating autophagic flux”（IF2022:10.787）。

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該研究首先通過孟德爾隨機(jī)化分析以證明 MDS與骨礦物質(zhì)密度(BMD)之間存在的的潛在因果聯(lián)系。總結(jié)了已經(jīng)報(bào)道的MDS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和可能作用的靶位，發(fā)現(xiàn)GSTP1可能影響B(tài)MD，利用RT-qPCR檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性基因RUNX2的表達(dá)量、敲低或過表達(dá)GSTP1發(fā)現(xiàn)GSTP1與成骨細(xì)胞分化關(guān)系不大，結(jié)合骨髓單細(xì)胞分析和Western Blot發(fā)現(xiàn)GSTP1在骨髓單核細(xì)胞中高度表達(dá)，且在老年女性和年輕女性中出現(xiàn)差異，發(fā)現(xiàn)GSTP1對(duì)BMD的影響更可能通過破骨細(xì)胞發(fā)生。

自噬對(duì)破骨細(xì)胞分化有廣泛的影響，本文從自噬角度繼續(xù)探究GSTP1如何影響破骨細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)rGSTP1刺激后出現(xiàn)了更多的自噬囊泡和吞噬囊泡，選擇哺乳動(dòng)物自噬蛋白LC3的作為自噬通量標(biāo)記物，作者通過比率流式法和自噬雙標(biāo)慢病毒檢測(cè)過表達(dá)或敲低GSTP1時(shí)不同細(xì)胞系在破骨細(xì)胞形成過程中的自噬通量改變。而自噬激活劑雷帕霉素通過激活自噬通量逆轉(zhuǎn)了低水平GSTP1促進(jìn)的破骨細(xì)胞形成。上述結(jié)果證明GSTP1可以通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化過程中的自噬通量來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的發(fā)生。

雷帕霉素以mTOR為靶點(diǎn)，mTOR參與哺乳動(dòng)物自噬主要通過ERK或PI3K-AKT通路激活，為了確定GSTP1在破骨細(xì)胞分化過程中對(duì)自噬的調(diào)控是否通過mTOR完成，刺激下分化 5天BMMs，在磷酸化水平上與對(duì)照組沒有差異，利用敲低和轉(zhuǎn)染，探究GSTP1和磷酸化 Pik3r1、AKT水平之間的關(guān)系，結(jié)果表明GSTP1調(diào)控的自噬通量是通過Pik3r1-AKT-mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)來完成的。

進(jìn)一步驗(yàn)證GSTP1下游激酶活性的調(diào)控是否與S-谷胱甘肽有關(guān)，作者探索了Pik3r1更微觀的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，首先，不同物種的初步序列比對(duì)顯示Pik3r1中的4個(gè)半胱氨酸（Cys498，Cys656，Cys659，Cys670）在進(jìn)化上是保守的，表明半胱氨酸殘基在Pik3r1功能的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示過表達(dá)和敲低GSTP1在破骨細(xì)胞形成過程中改變了Pik3r1的S-谷胱甘肽化水平，進(jìn)而下調(diào)了Pik3r1作為激酶的磷酸化水平。

接著，通過非還原非變性免疫共沉淀以及氧化還原相關(guān)修飾質(zhì)譜堅(jiān)定到Cys498和Cys670可以發(fā)生S-谷胱甘肽化。此外，分子蛋白對(duì)接的結(jié)果也表明，Cys498和Cys670更容易與GSH發(fā)生相互作用。二維圖像清楚地顯示谷胱甘肽與蛋白質(zhì)Pik3r1-CYS498共價(jià)對(duì)接后，谷胱甘肽與GLN499和GLU502形成氫鍵，與LYS532和GLU502發(fā)生靜電相互作用；同樣地，Pik3r1-CYS670與配體GSH對(duì)接的二維圖譜顯示，小分子GSH與HIS669、HIS668、ARG649、VAL671形成氫鍵，與ARG649存在靜電相互作用。

綜上，作者確定了Cys498和Cys670是Pik3r1發(fā)生S-谷胱甘肽化的兩個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)。

為了闡明GSTP1介導(dǎo)的Pik3r1的S-谷胱甘肽化在破骨細(xì)胞生成中的作用，作者先用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除RAW264.7細(xì)胞中的Pik3r1，排除內(nèi)源Pik3r的影響，然后用丙氨酸替代其中可能發(fā)生S-谷胱甘肽化半胱氨酸位點(diǎn)，構(gòu)建了3個(gè)單位點(diǎn)突變質(zhì)粒和1個(gè)雙位點(diǎn)突變質(zhì)粒。最后，將這些突變質(zhì)粒和野生型myc-Pik3r1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Pik3r1-KO的RAW細(xì)胞中完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。源井基因編輯提供了CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了Pik3r1的敲除RAW264.7細(xì)胞系（如下圖），為后續(xù)的突變回補(bǔ)驗(yàn)證奠定了重要基石。

在破骨細(xì)胞形成過程中，共免疫沉淀的結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染了C498A和C670A 突變質(zhì)粒的細(xì)胞中，GSTP1介導(dǎo)的Pik3r1 S-谷胱甘肽化水平低于轉(zhuǎn)染了野生型質(zhì)粒的細(xì)胞。但在轉(zhuǎn)染了C656A突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Pik3r1的S-谷胱甘肽化水平?jīng)]有顯著差異。此外，作者同時(shí)突變Cys498和Cys670，并將雙突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Pik3r1-KO的Raw264.7細(xì)胞中。在相同條件下，免疫共沉淀結(jié)果顯示GSTP1介導(dǎo)的S-谷胱甘肽化水平被完全消除（圖7F），這有力地證明了破骨細(xì)胞生成過程中GSTP1介導(dǎo)的Pik3r1的S-谷胱甘肽化是通過Cys498和Cys670實(shí)現(xiàn)的。

至此，作者通過詳盡的體外實(shí)驗(yàn)證明Cys498和Cys670是GSTP1介導(dǎo)的Pik3r1發(fā)生S-谷胱甘肽化的兩個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，并且這種氧化還原相關(guān)的修飾可以通過Pik3r1-AKT-mTOR級(jí)聯(lián)通路調(diào)節(jié)自噬通量并最終抑制破骨細(xì)胞生成。

該研究通過大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索了GSTP1重塑破骨細(xì)胞相關(guān)骨穩(wěn)態(tài)的一種全新機(jī)制，第一次詮釋了破骨細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)是由GSTP1介導(dǎo)的氧化還原相關(guān)的翻譯后修飾-自噬流級(jí)聯(lián)軸來決定的。