今天小薇繼續(xù)帶大家來(lái)解讀過(guò)表達(dá)的Co-IP（標(biāo)簽融合）圖片。

PS：文末還有蛋白標(biāo)簽的小知識(shí)，歡迎翻閱~

文獻(xiàn)實(shí)例：（PMID: 29368606，IF=41.444）

PKN2通過(guò)直接結(jié)合和激活DUSP6降低Erk1/2的磷酸化

背景簡(jiǎn)介

蛋白激酶N2（PKN2）是PKC相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作者實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PKN2通過(guò)抑制Erk1/2磷酸化抑制IL4和IL10的表達(dá)。雙特異性磷酸酶6 （DUSP6）是一種細(xì)胞質(zhì)MAP激酶磷酸酶，可作為Erk1/2的抑制劑。然后免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKN2與DUSP6在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，且磷酸酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染/敲除PKN2后顯示PKN2增加了結(jié)腸癌細(xì)胞系DUSP6的活性。然后作者通過(guò)CoIP實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白PKN2和DUSP6相互關(guān)系做了進(jìn)一步驗(yàn)證（f，g圖）。

方法描述

結(jié)果解讀

三種細(xì)胞HCT116、SW480和HT-29中DUSP6和PKN2的Co-IP實(shí)驗(yàn)

與第一期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，左邊實(shí)驗(yàn)組，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，右邊蛋白DUSP6和PKN2的WB表達(dá)情況，上面代表不同細(xì)胞系。

實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性（可查看Input組，代表陽(yáng)性結(jié)果），則可以證明兩個(gè)蛋白DUSP6和PKN2存在相互關(guān)系。本文中可能input組中的PKN2在HCT116和SW480細(xì)胞中表達(dá)量較低。

所以，又做了兩個(gè)蛋白過(guò)表達(dá)的Co-IP實(shí)驗(yàn)，這個(gè)就是小薇第一期最后說(shuō)的那個(gè)解決辦法。如果蛋白本身在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量就比較低，不好檢測(cè)出來(lái)（本文中的PKN2在HCT116和SW480細(xì)胞中表達(dá)量較低），針對(duì)這種情況建議就做一個(gè)過(guò)表達(dá)Co-IP實(shí)驗(yàn)。

一般來(lái)講，非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，通常為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)、提高IP效率會(huì)讓外源蛋白帶上標(biāo)簽（本文中的flag和HA標(biāo)簽）。

在293 T細(xì)胞中設(shè)置了不同劑量(0、3和6 μg) HA –標(biāo)簽的PKN2-WT（過(guò)表達(dá)PKN2），查看HA –PKN2-WT和 flag–DUSP6的共表達(dá)情況。

左邊WB實(shí)驗(yàn)組（IP）、陽(yáng)性對(duì)照組（Input），最上邊細(xì)胞（293T細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞），右上代表293T細(xì)胞單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染各種質(zhì)粒（vector-flag、vector-HA、PKN2-WT-HA和DUSP6-flag），也就是co-IP實(shí)驗(yàn)分為5組，分別是flag+HA標(biāo)簽組（陰性對(duì)照）、flag標(biāo)簽+PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體、DUSP6-flag組、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體。

首先觀察input組，input組第一塊膠圖為利用anti-HA沉淀PKN2-HA標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)三個(gè)條帶都在130kd處有蛋白，說(shuō)明flag標(biāo)簽+PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體三組中都存在PKN2-HA且其大小為130kd。input組第二塊膠圖為利用anti-flag沉淀DUSP6-flag標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)三個(gè)條帶都在43kd處有蛋白，說(shuō)明DUSP6-flag組、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體三組中都存在DUSP6-flag且其大小為43kd。第三塊膠圖是內(nèi)參基因GAPDH的條帶。

其次來(lái)觀察IP組，這組是利用anti-flag沉淀DUSP6-flag標(biāo)簽蛋白，最后發(fā)現(xiàn)DUSP6-flag組、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA過(guò)表達(dá)載體三組湊可以沉淀下來(lái)DUSP6-flag復(fù)合蛋白。不同劑量的PKN2-HA蛋白對(duì)結(jié)果影響較大。

由此可以得到結(jié)論：兩個(gè)蛋白都存在的時(shí)候，當(dāng)DUSP6-flag蛋白被沉淀，PKN2-HA蛋白也會(huì)被共沉淀下來(lái)，PKN2蛋白與DUSP6蛋白之間存在相互作用，PKN2以劑量依賴的方式直接與DUSP6結(jié)合。

這里涉及到標(biāo)簽，簡(jiǎn)單做個(gè)小匯總。

標(biāo)簽蛋白的選擇：

蛋白標(biāo)簽大體可分為三大類(lèi)：遺傳標(biāo)簽、in vivo標(biāo)簽和in vitro標(biāo)簽，最為常用的是遺傳標(biāo)簽，即His，F(xiàn)lag，GST，AviTag，c-Myc、HA等。

首先，需要確定融合標(biāo)簽的目的，蛋白純化首選His-Tag，WB首選Flag-Tag，Co-IP可選擇Flag-Tag或其他常用標(biāo)簽如HA、cMyc，活細(xì)胞成像則應(yīng)該選擇熒光蛋白等。

好了，兩種比較經(jīng)典的co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖片解讀今天就講解完了。小薇提供語(yǔ)言潤(rùn)色、論文降重和專(zhuān)家評(píng)估，有需要的歡迎隨時(shí)來(lái)撩~同事，有任何問(wèn)題歡迎添加小薇VX隨時(shí)溝通。