前言

2020年9月，加州大學(xué)的Minnie M. Sarwal課題組在Frontiers in?Medicine發(fā)表的題為的研究成果，通過(guò)單細(xì)胞蛋白組學(xué)研究方法，分析正常人近端腎小管和腎小球區(qū)域的腎臟細(xì)胞，研究為解開(kāi)急性和慢性腎臟疾病病因和腎臟亞細(xì)胞功能擾動(dòng)提供依據(jù)。

中文標(biāo)題：正常人腎臟近端腎小管和腎小球的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析

研究對(duì)象：人體腎臟組織

發(fā)表期刊：Frontiers in?Medicine

影響因子：5.091

發(fā)表時(shí)間：2020年9月

運(yùn)用重點(diǎn)組學(xué)技術(shù)：單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

研究背景

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的分析可以揭示臨床組織的細(xì)胞群差別，有助于了解腎臟生物學(xué)和分子功能，但基于單細(xì)胞蛋白組分析的方法需求尚未得到滿足。與基因組學(xué)不同，蛋白組學(xué)技術(shù)可以提供細(xì)胞狀態(tài)和調(diào)控的功能信息，在本研究中探究了單細(xì)胞蛋白組學(xué)方法，該方法實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的蛋白組學(xué)檢測(cè)。作者處理11個(gè)人體腎臟組織，通過(guò)μPOTS 收集、處理樣本的蛋白組學(xué)表達(dá)，與高靈敏度的LC-MS/MS 結(jié)合使用，建立了一種自動(dòng)化的 μPOTS 方法，實(shí)現(xiàn)了10~100個(gè)激光捕獲顯微切割（LCM）腎細(xì)胞中約3000種蛋白的定性和定量。該技術(shù)有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和獨(dú)特的蛋白標(biāo)志物，并有助于進(jìn)一步探討預(yù)后和不同腎臟疾病亞型中的蛋白組學(xué)異質(zhì)性。

研究思路

（點(diǎn)擊圖片查看大圖）

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)樣本：人體腎臟組織（腎小球和近端小管，n=11）

2. 實(shí)驗(yàn)分組

（1） FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）+OCT組（n=2）

（2） OCT組（n=9）

3. 切片厚度：一個(gè) 5 μm（ H&E 染色） 和三個(gè) 10 μm 厚的連續(xù)切片

4. 質(zhì)譜儀：Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific)?

5. 搜庫(kù)軟件：MaxQuant

研究結(jié)果

OCT冷凍采集是腎臟組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究的優(yōu)選方法

對(duì)于相同數(shù)量的組織，OCT冷凍腎臟比來(lái)自同一腎臟的FFPE切片得到更多的蛋白質(zhì)，表明盡管組織包埋在石蠟切片中不到2個(gè)月，但FFPE中的蛋白質(zhì)有可能被降解。兩個(gè)人腎臟的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，兩個(gè)OCT腎臟之間鑒定的蛋白質(zhì)有84%重疊，83%的蛋白質(zhì)在兩個(gè)FFPE腎臟之間重疊(圖1B)。為評(píng)估不同收集方法之間的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)OCT組織蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生了更多具有高光譜計(jì)數(shù)≥5的蛋白質(zhì)，反映了OCT腎臟組織可能得到更好保存(圖1C)。OCT組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析也比FFPE組織采樣到更多獨(dú)特的蛋白質(zhì)(圖1D)。不考慮組織保存方法，在常見(jiàn)的生物途徑中也有很強(qiáng)的重疊，這些途徑包括小分子代謝過(guò)程、羧酸代謝過(guò)程、有機(jī)酸的代謝過(guò)程和藥物代謝過(guò)程。這一數(shù)據(jù)突顯了腎臟組織的蛋白質(zhì)組學(xué)，無(wú)論在兩種測(cè)試方法的如何保存組織，檢測(cè)結(jié)果都是高度重復(fù)的。

圖1 | (A)研究樣本和化驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)。(B)使用OCT組織的過(guò)程的重現(xiàn)性的質(zhì)量控制圖。(C)比較OCT和FFPE中374種常見(jiàn)蛋白質(zhì)的光譜計(jì)數(shù)分布。(D)比較FFPE中76個(gè)獨(dú)特蛋白質(zhì)和OCT中244個(gè)獨(dú)特蛋白質(zhì)的光譜計(jì)數(shù)分布。

腎組織蛋白質(zhì)組學(xué)在運(yùn)輸?shù)腛CT冷凍腎臟組織上具有高度的重復(fù)性

分析了在兩個(gè)地點(diǎn)(加州大學(xué)舊金山分校和俄亥俄州立大學(xué))產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，在兩個(gè)不同地點(diǎn)處理的同一腎臟中，通常有70%的蛋白被鑒定出來(lái)(光譜計(jì)數(shù)≥5)。更重要的是，從一個(gè)中心站點(diǎn)運(yùn)來(lái)的兩個(gè)腎臟產(chǎn)生的數(shù)據(jù)高度相關(guān)，說(shuō)明現(xiàn)有的組織處理分析方案可靠。

使用激光捕獲顯微切割(LCM)優(yōu)化捕獲腎細(xì)胞

將不同厚度的OCT切片安裝在同一腎臟(n=2)的PET玻片上，分別在5、10和20微米厚度下測(cè)試LCM的可重復(fù)性。在使用蔡司Palm微束激光顯微切割系統(tǒng)(Cut Energy，64；Cut Focus，75)的連續(xù)LCM測(cè)試中，10微米切片被發(fā)現(xiàn)是最理想的，捕獲效率最高。

正常人腎臟亞室細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定豐富且獨(dú)特的腎小球和近端腎小管蛋白

在用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)處理的9個(gè)正常人類(lèi)腎臟中，平均每個(gè)腎小球（GLOM）/近端腎小管（PT）部分有10-40個(gè)細(xì)胞輸入，平均每個(gè)樣本鑒定出有2,560個(gè)蛋白質(zhì)。很多的結(jié)構(gòu)腎臟蛋白不是特異性的，在兩個(gè)亞室的直接比較中，208個(gè)蛋白質(zhì)在GLOM中富含，67個(gè)蛋白質(zhì)在GLOM中獨(dú)特存在(在PT中缺失)；247個(gè)蛋白質(zhì)在PT中富含，25個(gè)蛋白質(zhì)在PT中獨(dú)特存在(在GLOM中缺失)。

進(jìn)行交叉批次驗(yàn)證，盡管這些數(shù)據(jù)來(lái)自不同的正常腎臟隊(duì)列(圖2A)，即使有一小部分獨(dú)特的腎臟(第一批中有兩個(gè)，第二批中有四個(gè))，210個(gè)Glom豐富的蛋白質(zhì)也在兩個(gè)獨(dú)立的組之間高度相關(guān)，并在不同的時(shí)間進(jìn)行了分析。246個(gè)PT豐富的蛋白也可以在兩個(gè)不同的正常腎臟隊(duì)列中相關(guān)(圖2B)。結(jié)果表明，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)能夠重復(fù)地識(shí)別腎臟不同單位保守的亞室特異性蛋白質(zhì)。

圖2 | (A)兩批不同批次的獨(dú)立腎臟樣本之間腎小球中顯著富含的一組210種蛋白質(zhì)的相關(guān)性。批次1來(lái)自2個(gè)腎臟，批次2來(lái)自4個(gè)腎臟。(B)近端小管和腎小球中顯著富含的246種蛋白質(zhì)在兩批之間的相關(guān)性。

單細(xì)胞蛋白組學(xué)評(píng)估的 Glom 和 PT 標(biāo)記的驗(yàn)證

圖3A，B表示了那些未被IHC檢測(cè)到的蛋白質(zhì)(標(biāo)記有?)或無(wú)法獲得的數(shù)據(jù)(標(biāo)記有??)。作者取了前26個(gè)GLOM豐富的蛋白質(zhì)和26個(gè)PT特異蛋白質(zhì)，并通過(guò)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)(scRNA序列數(shù)據(jù))進(jìn)行“交叉組學(xué)”整合和驗(yàn)證(圖3B)。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)Glom和PT標(biāo)記進(jìn)行綜合分析的結(jié)果表明，一些已知的Glom和PT標(biāo)記蛋白具有很強(qiáng)的相關(guān)性。除了驗(yàn)證已知的標(biāo)記蛋白，單細(xì)胞蛋白組學(xué)還識(shí)別了在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集中或IHC數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的低豐度蛋白質(zhì)。例如，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中的PITPNB是一種高度濃縮的腎小球標(biāo)志物；然而，該基因在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中的檢測(cè)率較低，并且無(wú)法被IHC檢測(cè)到。SLC5A1的信號(hào)在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中得到增強(qiáng)，但在轉(zhuǎn)錄或IHC數(shù)據(jù)集中沒(méi)有增強(qiáng)(圖3C)。

圖3 | (A)熱圖顯示了5個(gè)正常腎臟(第2批)的蛋白質(zhì)豐度的不同分布。(B)人腎scRNA-seq數(shù)據(jù)基因表達(dá)圖譜的相關(guān)性。

GLOM和PT富含蛋白的生物學(xué)意義

作者使用通過(guò)單細(xì)胞蛋白組學(xué)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)來(lái)觀察在腎小球細(xì)胞或近端腎小管中顯著豐富的蛋白質(zhì)細(xì)胞。208個(gè)Glom富集區(qū)蛋白富含囊泡中間運(yùn)輸和細(xì)胞成分組織調(diào)節(jié)作為其最重要的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合是最重要的分子功能，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是最豐富的細(xì)胞成分。富含247個(gè)PT的蛋白質(zhì)主要集中在小分子代謝過(guò)程和藥物代謝過(guò)程中。在最重要的分子功能中，這些蛋白質(zhì)的氧化還原酶活性和催化活性豐富。

單細(xì)胞蛋白組學(xué)鑒定一組獨(dú)特的Glom和PT蛋白

除了GLOM或PT切片中的富集蛋白外，92種蛋白是GLOM(n=67)或PT(n=25)所特有的，只在腎小球細(xì)胞或近端腎小管細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。僅在腎小球細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)具有豐富的分子功能，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合等。僅在GLOM切片中發(fā)現(xiàn)的67種蛋白質(zhì)中，有41種已被報(bào)導(dǎo)存在于腎臟中，在這41種蛋白質(zhì)中，18種(43.9%)與單細(xì)胞蛋白組學(xué)結(jié)果一致，23種(56.1%)在GLOM中與小管相比沒(méi)有增加。

僅在PT切片中發(fā)現(xiàn)的25種蛋白質(zhì)中，有20種已被報(bào)告存在于腎臟中。這些蛋白質(zhì)具有豐富的分子功能，如羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、溶質(zhì)：鈉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等。在25個(gè)PT特異性蛋白質(zhì)中，19個(gè)蛋白質(zhì)亞集(95.0%)與單細(xì)胞蛋白組學(xué)結(jié)果一致，只有1個(gè)(5.0%)在小管中與GLOM相比沒(méi)有增加。

研究結(jié)論

此研究構(gòu)建了可應(yīng)用于腎臟疾病樣本的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法，有利于了解不同腎臟亞室中的蛋白質(zhì)變化，這些蛋白質(zhì)在腎臟疾病中的差異調(diào)節(jié)可以揭示腎小球與腎小管疾病表型的臨床和預(yù)后異質(zhì)性，有利于揭示腎臟損傷與恢復(fù)的新誘因，其中在腎臟特定區(qū)域發(fā)現(xiàn)的新途徑可以為藥物治療提供重要靶點(diǎn)依據(jù)。

小鹿推薦

蛋白組學(xué)技術(shù)可以提供細(xì)胞狀態(tài)和調(diào)控的功能信息，本研究建立了單細(xì)胞蛋白組學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的蛋白組學(xué)檢測(cè)。該技術(shù)有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，探討預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的不同腎臟疾病亞型中的蛋白組學(xué)異質(zhì)性和獨(dú)特的蛋白標(biāo)志物，為藥物靶點(diǎn)治療提供希望。

大規(guī)模單細(xì)胞分析對(duì)于捕獲復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)中的生物異質(zhì)性至關(guān)重要，但僅基于RNA技術(shù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)并不能很好地代表蛋白質(zhì)水平上的變化。而單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平上破譯細(xì)胞機(jī)制并且獲得更多的信息。

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