前言

腫瘤微環(huán)境（TME）影響患者對(duì)免疫治療的響應(yīng)度。攜帶大量生物活性分子的細(xì)胞外囊泡（EVs）可以在細(xì)胞間傳遞信號(hào)并重塑 TME。因此，在制定抗腫瘤治療策略時(shí)，應(yīng)綜合考慮 EVs、TME 和免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用。

近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院陳萬濤/嚴(yán)明團(tuán)隊(duì)，在 Journal of Extracellular Vesicles (IF: 25.841) 期刊在線發(fā)表了題為 “CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment” 的研究論文，研究表明頭頸鱗癌細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡（sEVs）運(yùn)載的 CD73 可以重塑 TME 并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、介導(dǎo)免疫逃逸。

研究內(nèi)容解析

HNSCC 細(xì)胞來源的 sEVs 中高表達(dá) CD73

從原代培養(yǎng)的頭頸鱗癌（HNSCC）細(xì)胞及配對(duì)正常黏膜細(xì)胞上清中分離 sEVs。蛋白組學(xué)分析顯示，與正常黏膜細(xì)胞相比，HNSCC 細(xì)胞來源的 sEVs 中高表達(dá) CD73（圖 f-h）。

圖1 | HNSCC 細(xì)胞來源的 sEVs 中高表達(dá) CD73

HNSCC 源 sEVs-CD73 被巨噬細(xì)胞內(nèi)化以促進(jìn) HNSCC 進(jìn)展

CD73 是由 NT5E 基因所編碼的一種膜結(jié)合形式的外核苷酸。TCGA 數(shù)據(jù)分析表明，NT5E 基因在包括 HNSCC 在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，并且與 HNSCC 患者較低的總體生存率密切相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示，CD73 在 HNSCC 腫瘤組織中高表達(dá)，并且與患者不良預(yù)后和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)。

免疫浸潤分析表明，NT5E 表達(dá)與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)（圖 c），免疫熒光結(jié)果也表明 CD73 與巨噬細(xì)胞共定位（圖 d-e）。

進(jìn)一步分析顯示，高 NT5E 表達(dá)、高巨噬細(xì)胞浸潤的 HNSCC 患者總體生存率最低（圖 f）。

圖2 | sEVs 中的 CD73 與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和 HNSCC 惡性進(jìn)展密切相關(guān)

小鼠移植瘤注射 sEVs，結(jié)果顯示 sEVs 主要與巨噬細(xì)胞共定位（圖 h-i），表明 sEVs 被巨噬細(xì)胞吞噬。同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖 j-n），腫瘤細(xì)胞來源的 sEVs 可以重塑引流淋巴結(jié)微環(huán)境，形成利于腫瘤轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，sEVs 攜帶的 CD73在這一過程中發(fā)揮重要作用。

sEVs 通過 CD73 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制

與對(duì)照相比，與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中 CD73 表達(dá)水平上升（圖 b）；而與 RAB27A 敲除以抑制 sEVs 釋放的細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比，其 CD73 含量與正常對(duì)照組相當(dāng)（圖 b），表明 CD73 主要通過 sEVs 運(yùn)輸。

sEVs 中 CD73 的水平會(huì)影響 CD73 巨噬細(xì)胞的比例，使其隨著共培養(yǎng)體系中 sEVs 的累積而增加。當(dāng) sEVs 被巨噬細(xì)胞內(nèi)化后，其吞噬作用明顯增強(qiáng)（圖 c），同時(shí)分泌促癌炎性細(xì)胞因子 IL6、IL10、TNFα、TGFβ 能力顯著增加（圖 e-f），預(yù)示 CD73 巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的促瘤作用。流式分析顯示（圖 h），sEVs 使巨噬細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)（PD-1，PD-L1，LAG3等）表達(dá)上調(diào)，表明 CD73 巨噬細(xì)胞可發(fā)揮更強(qiáng)的免疫抑制能力。

圖3 | HNSCC 細(xì)胞源 sEVs 中 CD73 對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響

sEVs 中的 CD73 在體內(nèi)促進(jìn)免疫逃逸并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

接下來評(píng)估 sEVs在介導(dǎo)體內(nèi)免疫抑制和腫瘤進(jìn)展中的作用。

與對(duì)照組相比，Rab27a 敲除組（SCC7Rab27aKO）的小鼠腫瘤生長速度慢、腫瘤偏小，表明 sEVs 可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

然而，注射外源性中高表達(dá)的 CD73 的 sEVs（sEVsSCC7-Nt5eOE 和 sEVsSCC7）則會(huì)顯著促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，但 NT5E 敲除的 sEVsSCC7-并沒有此作用（圖 b-d）。結(jié)果表明 sEVs 在 HNSCC 的進(jìn)展中具有重要的作用。

同時(shí)，流式分析顯示，sEVs 可招募巨噬細(xì)胞、Tregs 細(xì)胞，而 CD8 T 細(xì)胞浸潤數(shù)目減少。此外，在瘤內(nèi)注射了含 CD73 的 sEVs 后，這些免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞表面 CD73、PD-1 的表達(dá)水平均有所增加。

該體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，sEVs 可誘導(dǎo)免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

圖4 | sEVs 中敲除 CD73 可拯救免疫抑制并抑制了體內(nèi)腫瘤生長

攜帶 CD73 的 sEVs 通過激活 NF-κB 通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能

對(duì)經(jīng)過 HNSCC 源 sEVs 處理的 M2 巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。利用韋恩圖分析M2+HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs）相對(duì)于對(duì)照組 M2 上調(diào)的基因，以及 M2+CD73 敲除的 HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs）相對(duì)于 M2+sEVs 下調(diào)的基因。通過對(duì)兩組差異基因取交集，篩選出了共 143 個(gè)可能受到 sEVs 調(diào)控的候選下游基因（圖 a），而 NFκB1 是與這些差異表達(dá)基因最為相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（圖 b），富集分析也顯示 NF-κB 通路富集最為顯著（圖 c）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，sEVs 可以顯著促進(jìn) p65 在巨噬細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)積聚（圖 f），激活NF-κB 通路，并促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄。

圖5 | sEVs 中 CD73 通過 NF-κB 通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能

sEVs 是抗 PD-1 治療潛在的檢查點(diǎn)和治療靶點(diǎn)

從 HNSCC 患者血清中分離 sEVs，ELISA 檢測顯示其 CD73 含量高于健康人血清 sEVs（圖 a-c）。并且高水平的循環(huán) sEVs 可能預(yù)示著更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和更大的腫瘤大?。▓D d）。

為研究 sEVs 在抗 PD-1 治療中的作用，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估 sEVs 敲除聯(lián)合抗 PD-1 藥物對(duì)小鼠頭頸鱗癌的治療作用。當(dāng) sEVs 中 CD73 敲除時(shí)，PD-1抗體的治療效果發(fā)生明顯的改善（圖 f-h）。將瘤組織取出并進(jìn)行流式分析，在接受抗 PD-1 藥物后，巨噬細(xì)胞、Tregs 細(xì)胞的浸潤數(shù)量有所下降，CD8T 細(xì)胞的數(shù)目增加。同時(shí)，免疫細(xì)胞表面的 CD73 和 PD-1 表達(dá)下降，說明免疫抑制的現(xiàn)象有所緩解。這一現(xiàn)象在 RAB27aKO+anti-PD-1 組最為顯著，說明抑制腫瘤細(xì)胞的 sEVs 釋放會(huì)提高抗 PD-1 逆轉(zhuǎn)免疫抑制的效率。然而在加入外源性的 sEVs 后，巨噬細(xì)胞、Tregs 細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯上升，CD8T 細(xì)胞的數(shù)目減少。此外，免疫細(xì)胞表面的 CD73和 PD-1 表達(dá)上升，表明 sEVs ?顯著抑制了抗 PD-1 藥物對(duì)免疫應(yīng)答的重激活作用。

以上結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞源 sEVs 攜帶 CD73 通過 TAM 介導(dǎo)免疫抑制并減弱抗 PD-1 的治療效果。sEVs 可用于預(yù)測 HNSCC 的轉(zhuǎn)移，是潛在的 HNSCC 抗 PD-1 治療的聯(lián)合免疫治療靶點(diǎn)。

圖6 | sEVs 可減弱抗 PD-1 治療敏感性

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院魯婷瑋、張瑱為論文的共同第一作者，文章中轉(zhuǎn)錄組測序由歐易生物完成。

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