小 M 不怕純化“難”，IP、WB 只等閑。泡了兩年實驗室的小 M，理論與實操經(jīng)驗共有，且看我如何闖過蛋白純化的幾道“關(guān)”。

第一關(guān) 產(chǎn)品選擇

小 M 敲黑板：此關(guān)最基礎(chǔ)也最重要，謹(jǐn)防“一步錯，步步錯”。

親和層析作為經(jīng)典、高效的純化方法，利用目的分子與填料配基之間特異且可逆的相互作用，可以從細(xì)胞裂解液或其他生物樣品中，一步純化得到較高純度目的分子。選擇一款合適的親和純化瓊脂糖，可以高效、便捷、可靠地從生物樣品中分離蛋白、抗體。如何選擇才叫“合適”？且聽我慢慢道來：

■ 抗體基礎(chǔ)知識篇，“知己知彼百戰(zhàn)百勝”

抗體 (Antibody)，又名免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)，是一種由 B 細(xì)胞產(chǎn)生的大型 Y 形糖蛋白?？贵w以一個或多個 Y 形單體存在，每個 Y 形單體由 4 條多肽鏈組成：兩條相同的重鏈 (Heavy Chain) 和兩條相同的輕鏈 (Light Chain) (圖 1)。

抗體重鏈 Fc 區(qū)域的特異性序列決定了 Ig 的類型，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。輕鏈則有兩種類型，分別為 λ?型和 κ 型。

圖 1. 抗體結(jié)構(gòu)

■ 抗體——配體要相配！

心心念念純化人源 IgG3，一通操作后，目的條帶位置空空如也。最后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初選擇了 Protein A 當(dāng)親和配體。人源 IgG3 和 Protein A，不相配！λ 輕鏈和 Protein L，不相配！蛋白純化也講究門當(dāng)戶對。
抗體的親和純化配體包括 Protein A、Protein G、Protein L 等。對于多數(shù)哺乳動物，Protein G 比 Protein A 對 IgG 有更高的親和力，如人 IgG3、小鼠 IgG1 和大鼠 IgG2a，但 Protein G 不能和人的 IgM、IgD、IgA 等結(jié)合。
與 Protein A、Protein G 相比，Protein L 具有更廣譜的 Ig 結(jié)合能力，幾乎可結(jié)合所有含有 kappa 輕鏈的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及單鏈可變片段 (scFv) 和 Fab 片段。謹(jǐn)記根據(jù)抗體類型，選擇合適的親和純化配體 (圖 2)。

圖 2. 人源抗體與 Protein A、Protein G、Protein L 結(jié)合能力對照表

第二關(guān) 使用方法選擇

MCE Protein A、Protein G、Protein L 瓊脂糖，可從血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或腹水中一步分離抗體；Anti-Flag 親和凝膠 可通過 IP 等方法捕獲目的蛋白；鏈霉親和素瓊脂糖 則可和生物素化樣本高效結(jié)合。
抗體純化“大”實驗，IP、Pull Down“小”操作，重力柱“大”而離心管“小”焉。殺雞焉能用宰牛刀，產(chǎn)品詳細(xì)使用方法奉上 (如下方案僅供參考，詳見各產(chǎn)品使用說明)。

■?重力過柱法，適合從血清等生物樣本中分離、純化抗體。一次實驗獲得大量抗體，妙！

1）裝填：根據(jù)樣品量取適量的瓊脂糖填料加入親和層析柱，讓儲存液靠重力流出；

2）平衡：隨后用平衡 Buffer 對柱子進(jìn)行平衡；

3）上樣、洗雜：將樣品上到平衡好的柱子上后，繼續(xù)用平衡 Buffer 進(jìn)行雜質(zhì)的清洗和去除。4）洗脫：最后用洗脫 Buffer 將目的樣品洗脫。

圖 3. 重力過柱，純化抗體

■?離心法，適合通過 IP 捕獲蛋白或研究蛋白-蛋白間相互作用。精細(xì)化操作，穩(wěn)！

將 Anti-Flag 親和凝膠吸入離心管，使用離心法操作。離心的方式同樣經(jīng)平衡?→?上樣?→?洗雜?→?洗脫四個步驟，前三個步驟 Buffer 的置換通過離心棄掉上清來實現(xiàn)，最后洗脫時離心收集上清。

圖 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用步驟

第三關(guān) 目的蛋白結(jié)合、洗脫

Input 明明有目的蛋白，目的蛋白明明已結(jié)合，但洗脫液中卻沒有目的條帶。巧設(shè)對照，巧留樣，蛋白洗脫，我在行。
■ 巧婦難為無米之炊，想讓我“無中生有”？No Way！

檢測結(jié)果無條帶，也許是以下原因。

PS：設(shè)置 Input 對照，確定目的蛋白已表達(dá)；保留上樣后的流出液/離心后上清液，確定樣本已結(jié)合。每步操作“留一手”，全面復(fù)盤 (分析實驗失敗原因) 有幫助。

■ ?“變性”？“非變性”？下游實驗應(yīng)用來決定

1）變性洗脫法????? 此方法洗脫的蛋白樣品后續(xù)可直接做 SDS-PAGE 檢測，簡便、高效。

2）非變性洗脫法?? 此方法洗脫的蛋白樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。常用的有酸性洗脫法，低 pH 水平可以解離大多數(shù)抗體-抗原相互作用。
■ 洗脫后雜帶多、純度低

面對這個棘手的問題，我們首先需要分析雜蛋白的來源：是來自于目的蛋白的降解產(chǎn)物？與填料的吸附？還是與目的蛋白的互作？
1）蛋白部分降解：使用恰當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?；如對于?pH 環(huán)境很敏感，需在洗脫前的接收管中提前加入中和液。

2）蛋白非特異性結(jié)合在抗體、凝膠或離心管壁上，建議對裂解液進(jìn)行預(yù)處理，去除非特異性蛋白；在最后一次洗滌前，將樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中操作；洗滌效果不佳，建議增加洗滌時間及次數(shù)，增加洗滌 Buffer 中 NaCl 或去垢劑的濃度等。

第四關(guān) WB

這里來抄個作業(yè)，3、2、1，上鏈接我就不信這個邪！打破 Western Blot 玄學(xué)操作。

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相關(guān)產(chǎn)品

親和層析柱

Affinity Chromatography Column 可以搭配填料，用于純化具有不同標(biāo)簽的酶、抗體、抗原、重組蛋白等。

谷胱甘肽瓊脂糖

Glutathione Agarose 以高度交聯(lián)的 4% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，可實現(xiàn)高產(chǎn)量，高純度的 GST 標(biāo)記蛋白的純化。

Protein A 瓊脂糖

MCE Protein A Agarose 以高度交聯(lián)的 4% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法定向、高效偶聯(lián)了重組 Protein A，可從動物腹水、血清、細(xì)胞分泌液上清等生物體液中一步分離、純化 IgG 等。

Protein G 瓊脂糖

MCE Protein G Agarose 以高度交聯(lián)的 4% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法定向、高效偶聯(lián)了重組 Protein G，可從動物腹水、血清、細(xì)胞分泌液上清等生物體液中一步分離、純化 IgG 或其片段。

Protein L 瓊脂糖

MCE Protein L Agarose 是用于一步分離、純化含 kappa 輕鏈抗體的親和層析介質(zhì)。

Anti-Flag 親和凝膠

MCE Anti-Flag Affinity Gel 用于細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞裂解物以及體外表達(dá)系統(tǒng)中 Flag 標(biāo)簽蛋白的免疫沉淀、蛋白純化實驗。

鏈霉親和素瓊脂糖

MCE Streptavidin Agarose 以高度交聯(lián)的 4% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法共價偶聯(lián)了重組鏈霉親和素，結(jié)合能力更強(qiáng)，每毫升介質(zhì)可結(jié)合 30 μg D-Biotin。

巰基偶聯(lián)瓊脂糖

MCE High-Affinity Iodoacetyl Agarose 通過化學(xué)方法共價偶聯(lián)了 Iodine acetic acid 衍生物，能夠簡單、快速地結(jié)合含巰基的蛋白、多肽等生物配體并形成穩(wěn)定的巰醚鍵，配體固定后可進(jìn)行親和純化實驗。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。