由于相較于常規(guī)代謝組學(xué)，除了代謝物定性、定量信息外，空間代謝組學(xué)還可以提供代謝物的空間信息，因此基于質(zhì)譜成像技術(shù)的空間代謝組學(xué)在癌癥研究中的應(yīng)用越來越廣泛。2022年9月，Georgia Institute of Technology 的Facundo M. Fernández團(tuán)隊在《Mass Spectrometry Reviews》期刊（IF：9.011）上發(fā)表題為“Advances in mass spectrometry imaging for spatial cancer metabolomics”的綜述文章，總結(jié)了近年來質(zhì)譜成像技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用，并提出了如可重復(fù)性低等需要解決的問題。

質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）已經(jīng)成為癌癥研究中的一項核心技術(shù)。這項技術(shù)可以在復(fù)雜的生物基質(zhì)中分析各種類型的生物分子，這使它非常適合于了解與疾病進(jìn)展相關(guān)的生化改變。目前已經(jīng)成功地使用質(zhì)譜分析包括血清、尿液、唾液和組織在內(nèi)的不同的生物樣本。而利用MS成像（MS imaging，MSI）的空間代謝組學(xué)可以直接觀察到組織中的代謝物分布，從而能夠深入了解特定結(jié)構(gòu)中與癌癥相關(guān)的生化變化。

近年來，MSI研究已被越來越多地被用于揭示與癌癥發(fā)展相關(guān)的代謝重編程，能夠發(fā)現(xiàn)具有診斷潛力的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。這篇綜述旨在為非專業(yè)人士介紹MSI實驗的基本原理，包括基礎(chǔ)知識、樣品制備過程以及數(shù)據(jù)分析策略等方面。同時，回顧了過去5年中與癌癥研究相關(guān)的MSI進(jìn)展如空間脂質(zhì)組學(xué)和糖類組學(xué)、采用三維和多模態(tài)成像MSI方法、以及在基于MSI的癌癥研究中實施人工智能/機(jī)器學(xué)習(xí)的研究。

Part.1

目前癌癥研究中的MS方法

作者在第一部分總結(jié)了現(xiàn)在癌癥研究中應(yīng)用的質(zhì)譜技術(shù)?；谫|(zhì)譜技術(shù)的各種組學(xué)為全面深入了解癌癥發(fā)展、指導(dǎo)藥物開發(fā)和治療方法提供了堅實的分子基礎(chǔ)。對于非成像質(zhì)譜技術(shù)而言，也就是常規(guī)的質(zhì)譜技術(shù)，比如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography‐MS，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography‐MS，LC-MS）以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（capillary electrophoresis‐MS，CE-MS），都已經(jīng)在多種癌癥的分子標(biāo)志物研究等方面中發(fā)揮重要作用。但是它們都有一個共同的缺點，即不能提供分子的空間分布信息。因此質(zhì)譜成像技術(shù)應(yīng)運而生。

MSI作為一種廣譜的，無標(biāo)簽的成像方法，可以對各種生物分子進(jìn)行空間可視化，比如蛋白質(zhì)、多肽、脂類、多糖、氨基酸以及寡核苷酸等。因此，MSI技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于眾多生物和臨床研究，并促進(jìn)了不同類型癌癥的空間代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展。

Part.2

MS的基本原則

第二部分開始簡介空間代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，以及樣本制備、數(shù)據(jù)處理等方面的注意事項。

空間代謝組學(xué)涉及對組織、器官和細(xì)胞中的代謝物（主要是分子量小于2000 Da的分子，如脂類、氨基酸和糖類）的空間分布和改變的研究。這類研究有助于可視化和準(zhǔn)確定位這些生物大分子的位置，為了解感興趣的生物過程（如疾病進(jìn)展機(jī)制）提供了一個額外的維度。一般來說，從空間代謝組學(xué)實驗中獲得的信息與存在于某些組織區(qū)域或微區(qū)、器官和細(xì)胞中的生物分子功能緊密相關(guān)。其他空間技術(shù)觀察到的組織變化或異常子結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)（如組織的異質(zhì)性），可以與這些化合物分子水平的改變聯(lián)系起來。在癌癥研究中，生物大分子豐度的空間信息和改變反映了癌癥的發(fā)展?？臻g分辨率的信息也可以與其他研究相關(guān)聯(lián)，如通過GC-，LC- ，CE-MS和NMR測量的生物液體中的蛋白質(zhì)、肽、代謝物和脂質(zhì)豐度的時間分辨率。因此，MSI在癌癥研究中得到了普及（圖1）。

圖1 | 自2010年起，谷歌學(xué)術(shù)中關(guān)于“mass spectrometry imaging”和“cancer”的發(fā)文量

進(jìn)行空間代謝組學(xué)研究有如下幾項注意點：

首先是樣品制備。MSI實驗工作流程的第一步是獲得高質(zhì)量的組織切片，因為這些切片的狀況和均勻性程度在很大程度上決定了MSI數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可重復(fù)性。有許多因素會影響MSI數(shù)據(jù)的質(zhì)量，比如樣本的生物特征、采集時間等。而樣本制備也是MSI研究中差異的主要來源。一般來說，采集組織后直接在液氮中速凍可能會由于冷凍時間不均一導(dǎo)致組織開裂或者破碎。因此，在冷凍前，組織可以被嵌入羧甲基纖維素和明膠水溶液中，然后再被冷凍，這樣樣本可以在-80°C儲存至少一年。在樣本切片時，也要使用冷凍切片機(jī)進(jìn)行，且應(yīng)避免組織的折疊、破裂和移位。

其次是質(zhì)量軸校準(zhǔn)。這是MSI工作流程中進(jìn)行可靠化合物鑒定的關(guān)鍵步驟。即使像FTICR這樣的高分辨率質(zhì)譜儀可以提供最精確的質(zhì)量測量（平均可以達(dá)到<1 ppm的質(zhì)量誤差），仍然需要適當(dāng)?shù)男?zhǔn)技術(shù)，以確保在數(shù)據(jù)收集期間有最小的質(zhì)量軸變化。

然后是批次效應(yīng)。在MSI實驗中，批次效應(yīng)可能來自于組織采集、儲存、切片及數(shù)據(jù)收集。實驗室環(huán)境、儀器條件和操作的變化也是批次效應(yīng)的來源。批次效應(yīng)存在于像素與像素之間，切片與切片之間，以及樣本與樣本之間。通常情況下，批次效應(yīng)會給一些變量帶來偏差，如峰值豐度，這導(dǎo)致不同樣品之間真正的生物差異被掩蓋。目前仍在努力嘗試解決MSI批次效應(yīng)，包括設(shè)計更穩(wěn)健的工作流程，選擇質(zhì)量控制樣本，以及開發(fā)更好的歸一化方法。

再次是可視化。在MSI實驗之后，特征（Features）可以被可視化為熱圖，逐個像素地顯示代謝物在組織中的分布和豐度。通過圖像反映整個組織中的實際分子分布是至關(guān)重要的。目前已經(jīng)有很多商業(yè)（如SCiLS Lab）和開源程序（如BioMap、MSiReader、Cardinal）應(yīng)用于此。

接下來是特征注釋和鑒定方面。為了進(jìn)行代謝途徑分析，必須對MSI質(zhì)譜特征進(jìn)行正確注釋。在癌癥研究中，代謝途徑分析會反映了癌癥的發(fā)病機(jī)制，而不正確的注釋會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，這一點至關(guān)重要。從MSI實驗中產(chǎn)生的完整質(zhì)譜中，可以獲得有限的結(jié)構(gòu)信息。因此，通過將測量的m/z值與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，只可能進(jìn)行假定的特征注釋。因此，在這一層次的分析中，準(zhǔn)確的分子量測定是至關(guān)重要的。后續(xù)在進(jìn)一步實驗中，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的使用可以為特征注釋和鑒定提供更好的幫助。

最后是數(shù)據(jù)分析方面。在數(shù)據(jù)處理步驟之后，通過采用如歸一化、數(shù)據(jù)壓縮（例如，使用分層聚類的空間分割）和縮放等處理，對MSI數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過數(shù)據(jù)分析特定代謝物或脂質(zhì)的豐度變化，然后可以與癌癥進(jìn)展相關(guān)聯(lián)，可以為癌癥研究提供幫助。例如，一些脂質(zhì)的改變可以反映細(xì)胞增殖、分化和凋亡?；诟淖兊拇x物特征的適當(dāng)統(tǒng)計模型也可以成為癌癥診斷的有力工具。常用的統(tǒng)計分析方法包括單變量分析（T-test、方差分析等）、多元統(tǒng)計分析（如主成分分析（principal- component analysis，PCA），偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），t-SNE（t‐distributed stochastic neighbor embedding）和UMAP（uniform manifold approximation and projection）等）、以及ROC（receiver operator characteristic）分析等。

Part.3

MSI在癌癥研究中的應(yīng)用

這一部分，作者討論了2017年以來MSI在空間癌癥代謝組學(xué)中的應(yīng)用。MSI技術(shù)在臨床上的實施也在迅速增加，機(jī)器學(xué)習(xí)的普及使MSI成為一個強(qiáng)大的癌癥診斷工具。利用三維MSI重建三維組織可以更全面地了解癌癥在高度異質(zhì)性組織上的擴(kuò)散。此外，單細(xì)胞水平的MSI可以提供癌癥發(fā)展的細(xì)節(jié)，而不需要對整個群體進(jìn)行平均化。

首先是脂質(zhì)相關(guān)的研究。脂質(zhì)是一類密切參與癌癥發(fā)病機(jī)制的化合物。據(jù)估計，有超過100萬個分子種類是脂類。它們的疏水烷基尾巴（或側(cè)鏈）的變化如鏈長，為脂類增加了各種生化特性。例如，研究表明，磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphatidylinositol phosphate，PIP）的側(cè)鏈在p53突變的癌細(xì)胞中會發(fā)生改變。脂質(zhì)分子的兩面性使得它們作為重要分子，在促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖和分裂方面發(fā)揮著重要作用。例如，癌細(xì)胞可以消耗、生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化各種類型的脂質(zhì)，以支持癌細(xì)胞的生長，并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供能量。同時，身體對癌癥的免疫反應(yīng)也會改變特定的脂質(zhì)途徑。因此，癌癥發(fā)展過程中脂質(zhì)豐度的改變被視為疾病對器官及其環(huán)境直接影響的結(jié)果，同時也是身體對介導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的相應(yīng)反應(yīng)。因此，針對脂質(zhì)進(jìn)行分析研究，可以為更深入了解癌癥發(fā)展機(jī)制提供幫助。

此外，眾多研究表明，脂質(zhì)可以作為早期癌癥的生物標(biāo)志物，也可以被用于手術(shù)決策。但脂質(zhì)分子的復(fù)雜組合性和多樣性導(dǎo)致了對其檢測和定量的困難，特別是在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中。MSI可以直接看到癌癥組織中的脂質(zhì)分布和豐度變化。通常，癌癥脂質(zhì)組學(xué)研究的MSI工作流程包括樣品收集和預(yù)處理、質(zhì)譜特征的獲取和可視化、特征注釋和數(shù)據(jù)處理，包括（但不限于）脂質(zhì)途徑分析、分類統(tǒng)計模型的開發(fā)和生物標(biāo)志物分析（圖2）。目前，MSI已被廣泛用于了解乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和胃癌等癌癥發(fā)病和發(fā)展機(jī)制。比如在對乳腺癌的研究中顯示，幾個重要的脂肪酸和甘油磷脂被確定為介導(dǎo)這些不同亞型的細(xì)胞信號傳導(dǎo)和凋亡的關(guān)鍵分子，為了解乳腺癌的進(jìn)展情況提供了線索。此外，MSI實驗也可以與已有的臨床工具和程序相結(jié)合，對癌癥的發(fā)展和診斷進(jìn)行更詳細(xì)的評估。例如一項關(guān)于前列腺癌的研究中，MSI結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)如組織學(xué)分級相結(jié)合，用于前列腺癌的診斷。

圖2 | 一個典型的利用MSI脂質(zhì)組學(xué)研究癌癥的流程

除脂質(zhì)外，糖類是細(xì)胞中另一類重要分子，參與了許多涉及癌癥進(jìn)展的生理病理過程，包括細(xì)胞粘附、細(xì)胞間相互作用、信號傳導(dǎo)、炎癥、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。具體來說，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞開始失去極性并獲得遷移性和侵襲性，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的主要過程。糖類水平的改變已被證明與此類過程密切相關(guān)。在最近一項關(guān)于人類透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）組織的研究中，發(fā)現(xiàn)帶有雙節(jié)N-乙酰葡糖胺（N‐glycans with bisecting N‐acetylglucosamine，GlcNAc）和多個巖藻糖基化殘基的N-糖與ccRCC的發(fā)展有關(guān)，并且主要分布在腎臟的近端小管區(qū)域。此外，對整個腎臟組織，包括皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎小球和近端腎小管中N-聚糖的全面繪制表明，有幾個ccRCC的特異性特征可用于劃分腫瘤。

三維組織結(jié)構(gòu)的重建對于更好地理解代謝物的空間分布、整個組織中代謝物的生化相互作用、信號傳導(dǎo)途徑和癌癥的發(fā)展非常重要。一般來說，在三維MSI實驗中，二維圖像從一系列相鄰的組織切片中獲得，然后將二維圖像“對齊”并合并成三維圖像數(shù)據(jù)集。因此，改進(jìn)三維模型重建的策略在MSI研究中至關(guān)重要。三維圖像匹配最直接的方法是將靶標(biāo)嵌入到組織切片上作為參考點。光學(xué)或MS圖像的解剖學(xué)特征也被用來對齊二維MS圖像。然而，對齊工作大多是手動進(jìn)行的，只有具有明確和可見結(jié)構(gòu)的組織才能準(zhǔn)確對準(zhǔn)。多變量技術(shù)，如t-SNE，也被用來簡化二維圖像維度的復(fù)雜性，將組織切片分割成光譜相似的區(qū)域。

目前，二維圖像間的對齊仍然具有挑戰(zhàn)性。三維模型中組織亞區(qū)的分配是三維MSI實驗的另一個主要挑戰(zhàn)，三維MSI數(shù)據(jù)分析的工作量仍然比較大。盡管有這些挑戰(zhàn)，3D MSI已被越來越多地應(yīng)用于癌癥研究。例如，一項研究中，通過對齊49個小鼠腦組織切片，構(gòu)建了一個3D大腦模型，以可視化轉(zhuǎn)移髓母細(xì)胞瘤的脂質(zhì)標(biāo)記（圖3A），并討論了幾種脂質(zhì)的分布及其在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用，為診斷和治療提供了見解。在另一項研究中，從162個連續(xù)的人類口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中重建了一個三維模型，將二維MS圖像與蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色圖像和免疫組化圖像進(jìn)行核對，構(gòu)建了三維模型（圖3B）。

圖3 | 3D質(zhì)譜成像的構(gòu)建

其他成像方式與MSI的結(jié)合分析可以大限度地獲得化學(xué)和生物信息。許多成像方式（包括顯微鏡、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、光譜學(xué)等）已經(jīng)成功地與MSI技術(shù)相結(jié)合，這些多模態(tài)成像技術(shù)已被廣泛用于癌癥研究。圖4顯示了多模態(tài)成像工作流程的幾個例子。顯微鏡工具大多與MSI一起被用于癌癥研究。例如，H&E染色已被廣泛用于癌癥病理學(xué)，并與各種MSI技術(shù)相結(jié)合。H&E染色的顯微圖像可以幫助觀察組織的形態(tài)，染色后看到的特定組織學(xué)特征可以幫助識別和區(qū)分組織中的腫瘤區(qū)域。免疫熒光（Immunofluorescence，IF）顯微鏡也可以與MSI結(jié)合。在治療胰腺導(dǎo)管腺癌的研究中，吉西他濱及其代謝物首先通過MSI進(jìn)行了可視化。在相同的組織上進(jìn)行IF分析，并與MSI圖像核對，以評估藥物誘導(dǎo)的腫瘤DNA損傷。

圖4 | 癌癥研究中，質(zhì)譜成像技術(shù)與其他成像技術(shù)如H&E的整合示例

近5年來，MSI在臨床研究中得到了越來越多的應(yīng)用，它提供了獨特的細(xì)胞類型特異性分子圖譜，直接顯示了腫瘤的異質(zhì)性，并有廣闊的化合物覆蓋面，使其成為目前臨床診斷工具的寶貴補(bǔ)充。研究發(fā)現(xiàn)，利用MSI發(fā)現(xiàn)的診斷性分子特征可以很準(zhǔn)確的識別腫瘤區(qū)域并將其與鄰近的健康區(qū)域區(qū)分開來。與組織學(xué)染色技術(shù)和多變量統(tǒng)計工具一起，MSI已被經(jīng)常用于準(zhǔn)確的腫瘤邊緣評估。比如MSI可以作為評估和定義胰腺癌手術(shù)切除邊緣的工具。另一項研究表明，MSI能夠在3分鐘內(nèi)幫助估計和確定膠質(zhì)瘤的切除邊緣，靈敏度為93%，特異性為83%。

MSI在藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用，可以通過可視化抗癌藥物在目標(biāo)組織中的空間分布，實現(xiàn)對抗癌藥物療效和效率的評估。因此，MSI已被用于指導(dǎo)抗癌藥物設(shè)計，監(jiān)測和優(yōu)化癌癥治療方法。目前也有研究采用MSI技術(shù)對藥物的藥代動力學(xué)耐藥性進(jìn)行考察，即藥物是否能以足夠高的濃度輸送到腫瘤中，以及這種藥物的空間分布。例如，一項研究利用MSI繪制了一種抗血管生成藥物舒尼替尼（sunitinib）在兔肝臟腫瘤組織中的分布圖，并展示了幾種不同腫瘤區(qū)域的異質(zhì)性藥物分布。

近年來，需要更有效的數(shù)據(jù)處理工具來適應(yīng)MSI的快速發(fā)展，因為現(xiàn)在每次實驗都會產(chǎn)生非常大的多維數(shù)據(jù)集，特別是在高（質(zhì)量和空間）分辨率條件下。從數(shù)據(jù)集中提取重要的生物化學(xué)信息是一個真正的挑戰(zhàn)。建立強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)模型是非常有意義的，它可以用來預(yù)測癌癥亞型，建立癌癥進(jìn)展模型，發(fā)現(xiàn)癌癥生物標(biāo)志物，并在早期階段診斷癌癥。因此，機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)已被廣泛地應(yīng)用于MSI研究，以解釋MSI數(shù)據(jù)并建立適當(dāng)?shù)念A(yù)測模型來分析新的臨床數(shù)據(jù)集。一些機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)算法已經(jīng)被開發(fā)出來，以提供更有效的MSI數(shù)據(jù)分析方法和癌癥生物學(xué)問題的答案。例如，從人類前列腺癌組織切片中收集的高度稀疏的MSI數(shù)據(jù)集被壓縮，并使用基于變異自動編碼器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（variational autoencoder neural network）的深度學(xué)習(xí)算法進(jìn)行聚類。這個網(wǎng)絡(luò)被訓(xùn)練來學(xué)習(xí)和捕捉用于預(yù)測原始數(shù)據(jù)集的光譜特征，可以在降低數(shù)據(jù)維度的同時避免光譜特征損失。然后，降維的數(shù)據(jù)集被用于通過腫瘤相關(guān)特征的聚類分析來識別前列腺腫瘤區(qū)域。該算法在小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織切片的三維MSI數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了進(jìn)一步測試，同樣表現(xiàn)出高效的數(shù)據(jù)壓縮和高質(zhì)量的光譜預(yù)測。

盡管MSI已經(jīng)成為空間代謝組研究中有前途的技術(shù)之一，并已經(jīng)開始了應(yīng)用。但為仍有一系列提高分析性能的挑戰(zhàn)，比如可重復(fù)性低、采集時間長、代謝物注釋難等。這些問題都在被研究者努力的解決。此外，如機(jī)器學(xué)習(xí)等方法的發(fā)展，也會對MSI研究提供幫助。因此，基于MSI的癌癥中的應(yīng)用研究將繼續(xù)增長。

小鹿時刻

這篇綜述較為全面地介紹了MSI技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用。基于MSI的空間代謝組學(xué)由于可以提供獨特的代謝物空間信息，在區(qū)分腫瘤與癌旁，腫瘤異質(zhì)性等研究中被廣泛應(yīng)用，可以為腫瘤發(fā)展、診療機(jī)制提供更為深入的代謝物-位置-功能方面的理解。

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