為了擴(kuò)大誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 的再生醫(yī)學(xué)的前景，人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (HLA) 基因的精確和有效的基因組編輯將有利于最大限度地減少由 HLA 類(lèi)型錯(cuò)配引起的免疫排斥。然而，人類(lèi) iPSC 系中多個(gè) HLA 基因 的臨床級(jí)基因組編輯仍未探索。在這里，我們優(yōu)化了與 GMP級(jí)別CRISPRCas9 基因組編輯，以同時(shí)編輯?HLA 純合 iPSC 中的三個(gè)基因位點(diǎn) （HLA-A、HLA-B 和 CIITA 基因）。在通過(guò)單個(gè) gRNA 誘導(dǎo)雙等位基因敲除方面，使用 HLA 純合 iPSC 與雜合 iPSC 相比具有一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。 RNA-seq 和流式細(xì)胞術(shù) 分析證實(shí)了 HLA 的成功去除，并證實(shí)了譜系特異性分化為心肌細(xì)胞。 我們還證實(shí)，基因組編輯的 iPSC 的多能性由三個(gè)胚層分化成功維持。此外，通過(guò)全基因組測(cè)序、核型分析和光學(xué)基因組作圖分析顯示，在某些克隆中未檢 測(cè)到明顯的基因組異常，而在其他克隆中觀察到意外的拷貝數(shù)丟失、染色體易位和復(fù)雜的基因組重排。我們的結(jié)果表明多維分析對(duì)于確?；蚪M編輯細(xì)胞的安全性和質(zhì)量的重要性。多維分析對(duì)生產(chǎn)和評(píng)估流程將成為 iPSC 臨床級(jí)基因組編輯的基礎(chǔ)。

我們使用 4D-Nucleofector（Lonza電轉(zhuǎn)儀 可聯(lián)系優(yōu)寧維獲取產(chǎn)品資料）?將 Cas9 蛋白和兩個(gè) gRNA （ HLA-A24-ex2g1 和 CIITA-ex3g5 ） 電轉(zhuǎn)化到 FfI14s04 克隆中。在干擾素 (IFN)-g 刺激 2 天后，通過(guò) HLAA 或 B 抗體染色和流式細(xì)胞術(shù) (FCM) 證實(shí)了大塊細(xì)胞 群中 HLA-A 和 HLA-B 蛋白的敲除效率。結(jié)果顯示，77.9% 的細(xì)胞表面HLA-A蛋白表達(dá)陰性，72.1%的細(xì)胞HLA-B蛋白表達(dá)陰性，提示實(shí)現(xiàn)了雙等位基因敲除。

為了更詳細(xì)地檢查 HLA-A、HLA-B 和 CIITA 目標(biāo)位點(diǎn) 的插入或刪除 (indel) 效率，進(jìn)行了目標(biāo)位點(diǎn)克隆和測(cè)序。我們從 41 個(gè)分析的克隆 (73.1%) 中選擇了 30 個(gè) HLA-A 敲除 (KO) iPSC 的克隆。我們進(jìn)一步對(duì)這些克隆進(jìn)行 Sanger 測(cè)序、 核型分析、WGS、RNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)分析，并評(píng)估分化潛能。 圖1C）。

如圖所示：

PCR+Sanger: 19/30 indel mutations

WGS: 3/11 large deletions, 1.4Mbp;1 off-target（與成瘤相關(guān)）

核型： 7/30 translocations

OGM：隨機(jī)選取了9個(gè)進(jìn)行分析，4 個(gè)有易位

結(jié)論：基因編輯導(dǎo)致的unwanted effect 發(fā)生比例很高

我們通過(guò)測(cè)序和OGM 相結(jié)合，最終能更全面的檢測(cè)到Car-T的細(xì)胞質(zhì)量。

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