猴艾滋病動(dòng)物模型【動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外包】

（一）自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

嵌合的猴/人免疫缺陷病毒(simian/human immunodeficiency virus,SHIV)是將SIV的部分基因以HIV-1基因替代，構(gòu)建成的嵌合病毒，以研究 HIV不同基因的功能以及病毒與宿主的相互作用。例如，將SIVmac239的 tat、rev、env 基因替換為 HIV-1Lai 的 tat、rev,vpu、env基因，靜脈接種這種SHIV給恒河猴、食蟹猴。在接種后的1～2周內(nèi)，可以從所有接種的動(dòng)物血液中檢出高滴度的嵌合病毒，2~4周內(nèi)血清轉(zhuǎn)陽，CD4/CD8比例倒置,CD4+細(xì)胞數(shù)下降并出現(xiàn)淋巴腺病。這些動(dòng)物可用于研究對(duì)囊膜蛋白的免疫反應(yīng)與變異病毒增殖的相互關(guān)系。當(dāng)以SHIVSF33、SHIVSF162靜脈接種恒河猴后發(fā)現(xiàn)，不同 HIV毒株來源的env基因?qū)?SHIV的致病性有不同的影響；SHIVSF33可在動(dòng)物身上誘發(fā) SIVmac239 感染類似的病毒血癥，外周血淋巴結(jié)中的病毒量為SHIVSF162感染動(dòng)物的10~100倍，抗gp160抗體滴度也比 SHIVSF162感染的動(dòng)物高，這一模型適于分析 env基因的作用和評(píng)價(jià)針對(duì) env蛋白抗原的疫苗。

（二）誘發(fā)性動(dòng)物模型

【造模機(jī)制】猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)與 HIV 的生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)特征相似，對(duì)T細(xì)胞均有特殊嗜性。SIV的細(xì)胞受體為CD4，SIVcpz 含有HIV-1 特有的基因 vpu，SIVsm 和SIVmac 含有 HIV-2的特有基因 vpx。在親緣關(guān)系上SIVcpz 與 HIV-1 更接近，而SIVsm 和 SIVmac 與 HIV-2更接近。目前對(duì) SIV的研究多集中在 SIVmac 和 SIVsm 上,因?yàn)檫@兩種病毒能在多種獼猴屬動(dòng)物身上引發(fā)致死性免疫缺陷綜合征，同時(shí)伴發(fā)CD4+淋巴細(xì)胞下降、機(jī)會(huì)性感染、病毒性腦膜腦病。這些都與人類 AIDS 類似，因此現(xiàn)常以這兩株病毒感染動(dòng)物作為人類 AIDS研究用的重要的動(dòng)物模型。在恒河猴自然或?qū)嶒?yàn)感染SIV后能迅速發(fā)生 SAIDS。

【造模方法】SIV感染獼猴引起類似人類艾滋病的免疫缺陷綜合征。目前，最了解模型有 SIVmac 和 SIVsm 感染恒河猴的兩個(gè)模型系統(tǒng)。SIVmac 對(duì)恒河猴的感染大多為致死性持續(xù)性感染。病毒感染量與臨床結(jié)果無關(guān)，但是獼猴的存活能力與其抗體應(yīng)答強(qiáng)度呈正相關(guān)。其臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、消瘦、外用血 T4 淋巴細(xì)胞減少和對(duì)有絲分裂原增生應(yīng)答降低，機(jī)會(huì)性感染常見。

選健康成年恒河猴，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)體檢及血清檢查證實(shí)無SIV,SRV和 STLV-1 感染。儀器藥品：酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、毒株 SIVmac251、RPMI-1640等。模型制作：動(dòng)物常規(guī)麻醉，毒株 SIVmac251 以 3MID(3個(gè) 100%猴感染劑量)經(jīng)靜脈注射感染動(dòng)物。感染后2周血漿病毒分離陽性，證明造模成功。

模型檢測(cè)：

1.病毒分離 CEMx174 系人CD4+T淋巴細(xì)胞系。為一適用于SIV的亞克隆人T淋巴細(xì)胞系，生長(zhǎng)于完全 RPMI-1640中。取猴靜脈肝素抗凝血，離心2000r/min,30分鐘，吸取血漿200μ1，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于血漿SIVmac251滴度為 5,25,125,625,3125和15625 TCID/ml(tissue culture infective does），加入'24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔用完全RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)至1ml，再加入2×10°/ml CEMx174 細(xì)胞懸液0.5m1，在37℃、5%CO條件下培養(yǎng)4周。定期觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)，以出現(xiàn)CPE判斷為陽性記錄相應(yīng)稀釋滴度。

2.血漿SIV p27抗原水平測(cè)定 ELISA法：SIV-1 p27 Antigen ELISA Kit 試劑盒,操作程序按試劑盒說明書，在15分鐘內(nèi)上酶標(biāo)儀，在450nm下讀取OD值，結(jié)果以 pg/ml 表示。

3.血清抗體滴度的測(cè)定 間接免疫熒光法（IFA）：感染猴血清經(jīng)56℃、30分鐘滅活后,，從1：10開始做2倍的系列稀釋。滴加于SIVmac 感染 CEMx174 細(xì)胞抗原片病毒細(xì)胞孔上，同時(shí)設(shè)陽性及陰性血清對(duì)照，將玻片置37℃水浴箱濕盒中孵育40分鐘,用 0.1mol/L PBS洗片3次，每次8分鐘。甩干玻片，加抗猴 IgG熒光素結(jié)合物。37℃孵育40分鐘，用6.1mol/L PBS洗片3次，每次2分鐘，甩干。以50%甘油封片，置熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。

4.猴外周血CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù) 流式細(xì)胞儀法:取肝素抗凝血 2ml，收集外周單個(gè)核細(xì)胞于1.5ml Eppendorf管內(nèi)，用盡量少的液體將細(xì)胞懸起，加入鼠抗人CD4單抗,4℃孵育 30分鐘。1%FCS-PBS洗細(xì)胞3次，以少許液體重懸細(xì)胞，加入羊抗鼠 IgG-FITC 二抗,4℃避光孵育30分鐘，洗細(xì)胞3次，加入2%多聚甲醛 1ml,4℃固定過夜。次日以 300 目尼龍過濾，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果以占 PBMC中的百分率表示。

5.細(xì)胞培養(yǎng)和刺激 將分離所得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)用完全 RBMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整至細(xì)胞濃度為1×10*/ml，移入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求在各孔中分別加入終濃度為5μg/ml的ConA刺激液，另設(shè)不刺激對(duì)照，用完全 RBMI 1640培養(yǎng)液將孔內(nèi)液體補(bǔ)至1.5ml,將細(xì)胞置于37℃、5%CO，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激 72 小時(shí)。

6.細(xì)胞周期分析將培養(yǎng)至72小時(shí)的細(xì)胞移入離心管中，1000r/min 離心10分鐘。將上清移入0.5ml的小離心管，分裝凍存于-70℃保存，留待檢測(cè) IL-2水平使用。細(xì)胞經(jīng)1%FCS-PBS洗3次,用2%多聚甲醛磷酸緩沖液于4℃固定,過夜。次日,1%FCS-PBS 洗細(xì)胞2次，用碘化丙啶染液1ml重懸細(xì)胞，室溫孵育30分鐘，300目尼龍網(wǎng)過濾，上流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果以S期細(xì)胞百分比(S-phase fraction,SPF)和增殖指數(shù)(proliferous index,PI，即為S+G2+M期細(xì)胞百分比）表示。

【模型特點(diǎn)】感染動(dòng)物2周時(shí)血漿病毒滴度達(dá)到最高（1：3125）,4 周時(shí)下降到最低（1：5），其后雖有波動(dòng)但維持在低水平：同期的SIVp27抗原水平檢測(cè)顯示相同的規(guī)律。動(dòng)物在感染4周后、血清中檢測(cè)到針對(duì) SIVmac的抗體，且抗體水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高。感染后2周明顯下降、到4周時(shí)開始逐漸恢復(fù)。正常細(xì)胞在經(jīng)歷 Con A 72 小時(shí)刺激后,SPF和PI分別從4.5%和11.8%上升到49.9%和65.4%,說明正常細(xì)胞在這一刺激條件下，有半數(shù)以上的細(xì)胞由 G0/G1期進(jìn)入S期,（SPF達(dá)到了65.5%），表明有大量T淋巴細(xì)胞被活化。到感染第3周時(shí)，在同樣刺激條件下，進(jìn)入S期的細(xì)胞明顯減少，SPF僅為9.8%，表現(xiàn)出明顯的無反應(yīng)狀態(tài)（anergy)，而且直到感染4周時(shí)，這種狀態(tài)仍未恢復(fù)。未感染的正常淋巴細(xì)胞對(duì)Con A刺激具有高水平表達(dá)L-2的特點(diǎn)（從刺激前的4.5pg/ml上升到88.66pg/ml）。SIV感染后2周和4周,IL-2表達(dá)水平在同樣刺激下并無顯著增加，說明感染抑制了IL-2的產(chǎn)生和分泌。

感染最初大部分動(dòng)物有明顯的病毒血癥（viremia），表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、腹瀉和外周淺表淋巴結(jié)腫大等類似于人感染的臨床癥狀。此時(shí)病毒在體內(nèi)大量復(fù)制，隨后感染猴體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，血漿內(nèi)病毒水平開始下降，并伴有高水平的循環(huán)抗體出現(xiàn)，動(dòng)物一般能存活1～3年。在潛伏期，外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)減少，CD4+/CD8+比值下降。至感染后期，猴外周血中CD4+細(xì)胞逐漸下降，血漿病毒水平回升，并伴有體重下降、全身衰竭和機(jī)會(huì)感染（主要表現(xiàn)為頑固的腹瀉和肺炎）。最常見的并發(fā)癥為腹瀉，有間歇性或偶發(fā)性，易導(dǎo)致體重下降。約有20%～30%的感染猴因缺乏有效的免疫應(yīng)答而于數(shù)日內(nèi)死亡。大多數(shù)感染動(dòng)物的直接死因是嚴(yán)重腹瀉，用抗生素和支持療法均無效。動(dòng)物在病死前伴有體重下降，精神、食欲欠佳，不進(jìn)食，衰竭而死。另外，恒河猴感染 SIVsm的實(shí)驗(yàn)證明，盡管該病毒不引起其原有宿主的明顯疾病，但會(huì)引起另一種宿主與人類艾滋病相似的免疫缺陷病。

【注意事項(xiàng)】

1.由于近來發(fā)現(xiàn) SIV會(huì)感染違反規(guī)定進(jìn)行操作的實(shí)驗(yàn)室工作人員，且出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)陽，所以在從事 SIV有關(guān)的動(dòng)物模型研究時(shí)必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作。

2.因SIV與HIV在抗原結(jié)構(gòu)上的顯著差異，使該模型不能直接用來評(píng)價(jià)人類艾滋病疫苗的有效性。

【應(yīng)用范圍】SIV動(dòng)物模型主要用于下列3方面的艾滋病研究：

1.深入了解靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒的自然史和演變，并收集攜帶 SIV的野生動(dòng)物的種屬及這些病毒精確的基因組成。

2.確定艾滋病的發(fā)病機(jī)制。

3.發(fā)展艾滋病的疫苗和制訂治療對(duì)策SIV感染獼猴比用 HIV感染黑猩猩更易獲得疫苗方法的比較。

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