與病原體特異性免疫反應(yīng)不同，非特異性炎癥病變有助于正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化。盡管炎癥誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機制尚未完全闡明，但已證實長時間的炎癥對DNA突變和染色質(zhì)不穩(wěn)定發(fā)揮了刺激作用。因此，闡明癌癥相關(guān)的炎癥調(diào)節(jié)機制對癌癥預(yù)防和治療至關(guān)重要。RIG-I是一種模式識別受體(PRR)，與機體免疫反應(yīng)具有非常精密的聯(lián)系。有研究表明，RIG-I在肝癌中的表達呈下調(diào)趨勢，表明其與腫瘤免疫逃避有關(guān)。然而，在結(jié)腸癌模型小鼠中缺失RIG-1表現(xiàn)出更嚴重的腸道炎癥，并激活全身免疫反應(yīng)。因此進一步探索結(jié)腸癌中RIG-I缺失引發(fā)的持續(xù)性炎癥反應(yīng)的潛在機制或許能夠提供一種新的治療結(jié)腸癌的策略。

2022年8月，北京大學(xué)呂丹團隊在Nat commun發(fā)表文章“Mutant RIG-I enhances cancer-related inflammation through activation of CircRIG-I signaling”，在本文中，作者發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者中RIG-1基因存在移碼種系突變，并且攜帶RIG-1移碼突變的RIG-Ifs/fs小鼠更易發(fā)展為結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌。此外，移碼突變不僅中斷RIG-I mRNA的翻譯，而且能夠改變RIG-I前體mRNA的二級結(jié)構(gòu)并且抑制與DHX9的結(jié)合，最終誘導(dǎo)RIG-I轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生環(huán)狀RNA（CircRIG-I）。機制上，CircRIG-I與DDX3x相互作用，進而刺激MAVS/TRAF5/TBK1信號級聯(lián)，最終激活irf4介導(dǎo)的I型IFN轉(zhuǎn)錄，加重炎癥損傷。相反，全反式維甲酸作為DHX9激動劑，通過抑制CircRIG-I的生成改善免疫病理。綜上所述，該研究對移碼突變RIG-I的作用進行了深入的探索，并提出了一種治療結(jié)腸癌的潛在策略。

1、RIG-I突變與結(jié)腸癌的發(fā)展有關(guān)

首先作者對425個結(jié)腸癌患者血液進行測序分析后發(fā)現(xiàn)5例患者血液中RIG-I基因發(fā)生了移碼突變，而350例健康患者中沒有發(fā)現(xiàn)RIG-I基因突變。為了研究RIG-I的移碼變體的生物學(xué)功能，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了RIG-I移碼突變小鼠（RIG-Ifs/fs小鼠），并進一步使用氧化偶氮甲烷和右旋糖酐硫酸酯鈉(AOM-DSS)模型在RIG-Ifs/fs小鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸炎相關(guān)癌癥(CAC)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比RIG-Ifs/fs小鼠體重明顯下降，且在AOM-DSS處理后的RIG-Ifs/fs小鼠中結(jié)腸癌診斷標志物明顯升高。此外，RIG-Ifs/fs小鼠體內(nèi)腫瘤數(shù)量和大小均顯著增加，并且存在更多低級別腺癌。有趣的是，在AOM-DSS處理過程中，RIG-Ifs/fs小鼠的結(jié)腸中還能招募到更多的T細胞，這表明RIG-I移碼突變有助于結(jié)腸癌的發(fā)展。

2、Rig移碼突變增強機體炎癥反應(yīng)并促進CAC發(fā)展

為了進一步探究RIG-I移碼突變對CAC的影響，作者通過2%DSS單獨對RIG-Ifs/fs小鼠進行處理。結(jié)果顯示，在DSS治療后RIG-Ifs/fs小鼠比野生型小鼠表現(xiàn)出更高的死亡率、更短的結(jié)腸長度和更嚴重的結(jié)腸炎癥損傷。隨后作者對野生型和RIG-Ifs/fs小鼠結(jié)腸組織進行RNA測序(RNA-seq)分析，從而進一步研究RIG-I在宿主炎癥反應(yīng)中的作用。利用基因分析(GSEA)，作者發(fā)現(xiàn)RIG-I的移碼突變促進腸細胞表達更高水平的I型IFN信號相關(guān)的基因。此外，作者通過qPCR檢測實驗進一步發(fā)現(xiàn)在RIG-Ifs/fs小鼠肝臟中表達高水平的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（Tnf-α和Isg15）。以上結(jié)果表明，RIG-I移碼突變增強了上皮細胞I型IFN信號通路，加劇了組織炎性損傷。

3、RIG-I的移碼突變通過促進I型IFN的產(chǎn)生限制病毒的復(fù)制

由于RIG-I移碼突變對I型IFN的產(chǎn)生具有刺激作用，作者推測RIG-Ifs/fs小鼠可能對病毒感染具有抗性。因此，作者使用了水泡性口炎病毒(VSV)感染野生型和RIG-Ifs/fs小鼠。結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，RIG-Ifs/fs小鼠存活率顯著增高，并且小鼠肺部、脾臟和肝臟等多個器官的病毒復(fù)制均被抑制。與體內(nèi)數(shù)據(jù)一致，作者還觀察到RIG-Ifs/fs鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中病毒滴度較低，且IFN-stimulated基因的表達高于野生型MEFs。為了進一步證實RIG-I移碼突變在I型IFN調(diào)控中的作用，作者使用RNA-seq分析了RIG-Ifs/fs與野生型MEFs之間差異表達的基因。分析結(jié)果顯示，與對照細胞相比，RIG-Ifs/fs MEFs中主要富集I型IFN信號通路相關(guān)基因。而有趣的是，RIG-I在刺激機體先天免疫中發(fā)揮重要作用，所以RIG-I的缺失很難刺激I型IFN的產(chǎn)生，這與目前的結(jié)果相悖。因此，作者假設(shè)RIG-I的移碼突變不僅在轉(zhuǎn)錄后水平上影響RIG-I的表達，而且可能對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)具有刺激作用。

4、RIG-I突變觸發(fā)環(huán)狀RIG-I的生成

首先，作者利用RNAfold web預(yù)測RIG-I基因的RNA結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)移碼突變能夠損壞其RIG-I前體RNA的二級結(jié)構(gòu)。隨后作者通過查閱已經(jīng)發(fā)表的DHX9基因的CLIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DHX9作為調(diào)控環(huán)狀RNA生成的關(guān)鍵蛋白，能夠富集在RIG-I基因的Alu SINEs原件上。隨后，作者也通過RNA-pulldown證實RIG-I與DHX9之前存在互作。而RIG-I的移碼突變顯著降低了其與DHX9的結(jié)合。由于DHX9在調(diào)控環(huán)狀RNA生物發(fā)生中具有重要的作用，因此作者假設(shè)RIG-I的移碼突變可以觸發(fā)RIG-I轉(zhuǎn)錄本生成環(huán)狀RNA。不出所料，作者通過RNA-seq鑒定到來源于RIG-I基因第5和12外顯子的環(huán)狀RNA并將其命名為CircRIG-I。該環(huán)狀RNA主要存在于細胞質(zhì)中，且在感染病毒的RIG-Ifs/fsMEFs中顯著增加。以上結(jié)果表明，RIG-I的移碼突變觸發(fā)了CircRIG-I的產(chǎn)生。

5、CircRIG-I在結(jié)腸癌中上調(diào)并增強宿主免疫反應(yīng)

為了驗證CircRIG-I在組織中的表達情況，作者通過qPCR檢測到CircRIG-I在結(jié)腸癌組織中高表達，并且發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸癌中CircRIG-I的表達水平高于息肉樣結(jié)腸癌。此外，炎癥灶中CircRIG-I的表達也顯著高于正常組織，這也進一步證明了CircRIG-I參與腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)。隨后，作者為了確定CircRIG-I是否影響I型IFN的產(chǎn)生，通過使用shRNA在不影響線性的RIG-I的情況下選擇性地敲除CircRIG-I。實驗結(jié)果顯示，當VSV感染時抑制CircRIG-I表達在一定程度上削弱了野生型或RIG-Ifs/fs MEFs對I型IFN和ISG (Ifitm2)產(chǎn)生的刺激作用。而在HEK293T細胞中，CircRIG-I過表達能夠顯著抑制病毒復(fù)制，并且增強了I型IFN的產(chǎn)生和其他ISGs的表達。有研究報道I型IFN的產(chǎn)生與IRF3的磷酸化具有非常重要的作用，因此作者又在過表達CircRIG-I的細胞中檢測了IRF3的磷酸化情況。實驗結(jié)果顯示，在過表達CircRIG-I的細胞中，IRF3的磷酸化水平顯著升高。此外，與對照細胞相比，在過表達CircRIG-I的細胞中檢測到IRF3的二聚體和核積累也相應(yīng)增加。綜上所述，該結(jié)果確定了CircRIG-I在調(diào)節(jié)宿主先天免疫中的刺激作用。

6、CircRIG-I可激活DDX3x/MAVS/TRAF5/TBK1通路

為了探究CircRIG-I是否通過下游通路影響宿主免疫反應(yīng)，作者通過過表達帶有MS2標簽的CircRIG-I進行了RNA-pulldown實驗。對pulldown產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，DDX3x作為I型IFN信號通路的重要組成部分與CircRIG-I存在互作。為了研究CircRIG-I促進DDX3x激活的機制，作者使用免疫沉淀和質(zhì)譜(MS)來鑒定CircRIG-I過表達和敲低時DDX3x相關(guān)蛋白的動態(tài)變化。利用該方法，作者鑒定出多個與之前的報道一致的DDX3x相關(guān)蛋白，包括TBK1、EIF4G1和EIF3A等。進一步驗證后發(fā)現(xiàn)CircRIG-I促進了DDX3x與MAVS、TRAF家族(TRAF1、TRAF4和TRAF5)以及TBK1的關(guān)聯(lián)。從而表明CircRIG-I通過激活DDX3x刺激IRF3介導(dǎo)的先天免疫信號。

7、全反式維甲酸通過抑制CircRIG-I表達改善免疫病理

有研究報道，全反式維甲酸(ATRA)參與RIG-I表達的調(diào)控。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)ATRA治療也促進了Dhx9的表達，這對CircRIG-I的生物發(fā)生具有負調(diào)控左右。當通過ATRA處理野生型MEFs時，隨著ATRA劑量的增加，RIG-I mRNA表達水平逐漸上調(diào)，CircRIG-I表達也逐漸被抑制。而在RIG-I移碼突變的背景下，ATRA處理也能抑制CircRIG-I的表達。鑒于CircRIG-I的上調(diào)對于RIG-Ifs/fs小鼠的免疫應(yīng)答增強至關(guān)重要，因此作者推測ATRA處理可以改善用DSS治療的RIG-Ifs/fs小鼠的病理損傷。為此，作者在DSS存在的情況下使用ATRA處理野生型或RIG-Ifs/fs小鼠。結(jié)果顯示，盡管野生型小鼠的病理病變具有輕度緩解，但通過生存曲線、結(jié)腸長度和組織學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，ATRA顯著改善了RIG-Ifs/fs小鼠急性dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的結(jié)局。該結(jié)果表明，ATRA對治療RIG-I移碼突變引起的嚴重結(jié)腸炎癥具有非常重要的作用。

綜上所述，在本文中作者證明了RIG-I的移碼突變觸發(fā)CircRIG-I，進而激活DDX3x/MAVS/TRAF5/TBK1軸，最終促進I型IFN的產(chǎn)生和結(jié)腸炎癥損傷。與此相反，ATRA作為CircRIG-I的抑制因子，可治療RIG-I移碼突變引起的嚴重結(jié)腸炎癥。

原文鏈接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36402769/

參考文獻：

[1] Song Jia,Zhao Wei,Zhang Xin et al. Mutant RIG-I enhances cancer-related inflammation through activation of circRIG-I signaling.[J] .Nat Commun, 2022, 13: 7096.

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