? ? ? ?今天介紹的是CRISPR(Clustered?Regularly?Interspaced?Short?Palinmic?Repeats)——成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)。

簡介

? ? ??CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palinmic Repeats的首字母縮寫)是在細(xì)菌和古菌等原核生物的基因組中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)DNA序列家族這些序列來自于先前感染原核生物的噬菌體的DNA片段。在隨后的感染中，它們被用來檢測(cè)和破壞類似噬菌體的DNA。因此，這些序列在原核生物的抗病毒防御系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并提供一種獲得性免疫的形式。在大約50%的已測(cè)序細(xì)菌基因組和近90%的已測(cè)序古菌基因組中發(fā)現(xiàn)了CRISPR。

? ? ? ?Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)是一種酶，它使用CRISPR序列作為向?qū)碜R(shí)別和切割與CRISPR序列互補(bǔ)的特定DNA鏈。Cas9和CRISPR序列共同構(gòu)成了CRISPR-Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)，這種技術(shù)可以用來編輯生物體中的基因。這個(gè)編輯過程具有廣泛的應(yīng)用，包括基礎(chǔ)生物學(xué)研究、生物技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)和疾病治療。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的認(rèn)可，該獎(jiǎng)項(xiàng)授予了艾曼紐埃爾·夏彭蒂爾和詹妮弗·杜德納

歷史

重復(fù)序列

? ? ? ? DNA重復(fù)集群的發(fā)現(xiàn)分別發(fā)生在世界的三個(gè)地區(qū)。1987年，大阪大學(xué)的研究員Yoshizumi Ishino和他的同事首次對(duì)后來被稱為CRISPR的技術(shù)進(jìn)行了描述。他們意外地從他們的目標(biāo)大腸桿菌的基因組中克隆了部分CRISPR序列和“iap”基因(堿性磷酸酶的同工酶轉(zhuǎn)換)。重復(fù)節(jié)目的組織是不同尋常的。重復(fù)序列通常是連續(xù)排列的，沒有不同序列的穿插。他們不知道被打斷的集群重復(fù)的功能。

? ? ? ?1993年，荷蘭結(jié)核分枝桿菌的研究人員發(fā)表了兩篇關(guān)于該桿菌中一組中斷直接重復(fù)序列(DR)的文章。他們認(rèn)識(shí)到在結(jié)核分枝桿菌不同菌株之間直接重復(fù)序列的多樣性，并利用這一特性設(shè)計(jì)了一種名為spoligo分型的分型方法，該方法至今仍在使用

? ? ? ? 西班牙阿利坎特大學(xué)的Francisco Mojica研究了在嗜鹽富饒菌(Haloferax)和鹽豐產(chǎn)菌(Haloarcula)物種的古生物中觀察到的重復(fù)，以及它們的功能。Mojica的主管當(dāng)時(shí)推測(cè)，在細(xì)胞分裂過程中，聚集重復(fù)序列在將復(fù)制的DNA正確分離到子細(xì)胞中發(fā)揮了作用，因?yàn)榫哂邢嗤貜?fù)序列的質(zhì)粒和染色體不能在火山沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)中共存。同時(shí)首次記錄到中斷重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄;這是對(duì)CRISPR的第一個(gè)完整的描述。到2000年，莫?？▽?duì)科學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行了調(diào)查，他的一個(gè)學(xué)生用他自己設(shè)計(jì)的程序?qū)σ寻l(fā)表的基因組進(jìn)行了搜索。他們確定了20種微生物的中斷重復(fù)屬于同一個(gè)家族因?yàn)檫@些序列是間隔的，Mojica最初將這些序列稱為“短規(guī)則間隔重復(fù)序列”(SRSR)2001年，Mojica和Ruud Jansen在尋找更多的中斷重復(fù)序列時(shí)，提出了CRISPR(Clustered?Regularly?Interspaced?Short?Palinmic?Repeats)，以緩解科學(xué)文獻(xiàn)中用來描述序列的眾多首字母縮寫所造成的混亂。2002年，Tang等人證明了來自閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)基因組的CRISPR重復(fù)區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為長RNA分子，這些長RNA分子隨后被加工成單位長度的小RNA，加上一些較長的2、3或更多間隔重復(fù)單元形式

? ? ? ?2005年，酸奶研究人員Rodolphe Barrangou發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌在經(jīng)過噬菌體的反復(fù)攻擊后，噬菌體抗性增強(qiáng)，而這種增強(qiáng)的抗性是由于加入了額外的CRISPR間隔序列巴朗古當(dāng)時(shí)供職的丹麥?zhǔn)称饭镜つ崴箍?Danisco)后來開發(fā)出了耐噬菌體嗜熱鏈球菌，用于生產(chǎn)酸奶。丹尼斯克后來被杜邦公司(DuPont)收購，杜邦公司“擁有全球約50%的乳制品文化市場”，該技術(shù)也成為主流

CRISPR-相關(guān)系統(tǒng)

? ? ? ?Jansen觀察到原核生物重復(fù)簇伴隨著一組構(gòu)成CRISPR相關(guān)系統(tǒng)或cas基因的同源基因，這對(duì)理解CRISPR有一個(gè)重要的增加。初步鑒定出4個(gè)cas基因(cas 1-4)。Cas蛋白顯示解旋酶和核酸酶基序，表明其在CRISPR基因座的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用在本出版物中，CRISPR被用作這種模式的通用名稱。然而，CRISPR的功能仍然是個(gè)謎。

? ? ? ?2005年，三個(gè)獨(dú)立的研究小組表明，一些CRISPR間隔子來自噬菌體DNA和染色體外DNA，如質(zhì)粒。實(shí)際上，這些間隔層是從先前試圖攻擊細(xì)胞的病毒中收集來的DNA片段。這些間隔物的來源標(biāo)志著CRISPR/cas系統(tǒng)可能在細(xì)菌的適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用。提出這一想法的三項(xiàng)研究最初都被一些知名期刊拒絕，但最終都出現(xiàn)在了其他期刊上

? ? ? ? Mojica和阿利坎特大學(xué)的合作者發(fā)表的第一篇論文提出了CRISPR-Cas在微生物免疫中的作用，預(yù)測(cè)了間隔子的RNA轉(zhuǎn)錄本在目標(biāo)識(shí)別中的作用，其機(jī)制可能類似于真核細(xì)胞使用的RNA干擾系統(tǒng)。Koonin和他的同事擴(kuò)展了這一RNA干擾假說，他們根據(jù)不同CRISPR-Cas亞型蛋白的預(yù)測(cè)功能提出了它們的作用機(jī)制

? ? ? ?幾個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)工作揭示了CRISPR-Cas免疫的基本機(jī)制。2007年，首次發(fā)表了CRISPR是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。嗜熱鏈球菌的CRISPR區(qū)從感染噬菌體的DNA獲得間隔層。研究人員通過添加和刪除序列與被測(cè)試噬菌體中發(fā)現(xiàn)的序列相匹配的間隔子，來控制嗜熱鏈球菌對(duì)不同類型噬菌體的抗性。2008年，Brouns和Van der Oost發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Cas蛋白復(fù)合體(稱為Cascade)，該復(fù)合體在大腸桿菌中將重復(fù)序列中的CRISPR RNA前體切割成成熟的含有間隔層的RNA分子，稱為CRISPR RNA(crRNA)，該RNA分子仍然與蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合此外，還發(fā)現(xiàn)級(jí)聯(lián)、crRNA和解旋酶/核酸酶(Cas3)是提供細(xì)菌宿主對(duì)DNA病毒感染免疫所必需的。通過設(shè)計(jì)一種抗病毒CRISPR，他們證明了crRNA的兩個(gè)方向(正義/反義)提供了免疫，這表明crRNA向?qū)б詃sDNA為靶點(diǎn)。那一年，Marraffini和Sontheimer證實(shí)表皮葡萄球菌(Staphylococcus Epidermidis)的CRISPR序列是靶向DNA而不是RNA，以防止整合。這一發(fā)現(xiàn)與提出的CRISPR-Cas免疫的RNA干擾樣機(jī)制不一致，盡管后來在熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)中發(fā)現(xiàn)了一種靶向外源RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)。2010年的一項(xiàng)研究表明，CRISPR-Cas同時(shí)切斷了嗜熱鏈球菌的噬菌體和質(zhì)粒DNA鏈。

Cas9

? ? ? ?研究人員從化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中研究了一種更簡單的CRISPR系統(tǒng)，這種系統(tǒng)依賴于Cas9蛋白。Cas9核酸內(nèi)切酶是一個(gè)四成分系統(tǒng)，包括兩個(gè)小分子:crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier通過將兩個(gè)RNA分子融合成“sgRNA”，將Cas9核酸內(nèi)切酶重新設(shè)計(jì)成一個(gè)更易于管理的雙組分系統(tǒng)。當(dāng)Cas9與Cas9結(jié)合時(shí)，可以找到并切斷引導(dǎo)RNA指定的DNA靶標(biāo)。這一貢獻(xiàn)非常重要，因此在2020年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。通過操縱引導(dǎo)RNA的核苷酸序列，人工Cas9系統(tǒng)可以被編程為針對(duì)任何DNA序列進(jìn)行切割另一組合作者包括Virginijus ?ik?nys、Gasiūnas、Barrangou和Horvath，他們表明，來自嗜熱鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的Cas9也可以通過改變其crRNA的序列來對(duì)他們選擇的位點(diǎn)進(jìn)行重新編程。這些進(jìn)展推動(dòng)了用改良的CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯基因組的努力。

? ? ? ? 由張峰和喬治·丘奇領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)首次同時(shí)發(fā)表了使用CRISPR-Cas9對(duì)人類細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯的描述。自那以后，它被廣泛應(yīng)用于各種生物體中，包括面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)、螞蟻(Harpegnathos saltator與Ooceraea biroi)、蚊子(埃及伊蚊)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、植物、小鼠(Mus musus domesticus)、猴子和人類胚胎。

? ? ? CRISPR已經(jīng)被修飾成可編程的轉(zhuǎn)錄因子，允許科學(xué)家鎖定、激活或沉默特定的基因。

? ? ? CRISPR-Cas9系統(tǒng)已被證明可以在人類三原核合子中進(jìn)行有效的基因編輯，這一發(fā)現(xiàn)最早是在2015年由中國科學(xué)家梁平和徐勇發(fā)表的一篇論文中提出的。該系統(tǒng)成功地對(duì)54個(gè)胚胎中的28個(gè)進(jìn)行了突變體-血紅蛋白(HBB)的切割。28個(gè)胚胎中有4個(gè)使用科學(xué)家提供的供體模板成功重組。科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，在被切割的DNA鏈重組過程中，同源內(nèi)源性序列HBD與外源性供體模板競爭。與干細(xì)胞相比，人類胚胎中的DNA修復(fù)更為復(fù)雜和特殊。

Cas12a

? ? ? 2015年，核酸酶Cas12a(原名Cpf1)在新兇手弗朗西斯菌(Francisella novicida)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中被鑒定出來。其最初的名字來自于2012年建立的tigrfam蛋白家族定義，反映了其CRISPR-Cas亞型在普雷沃菌和弗朗西斯菌譜系中的流行程度。Cas12a與Cas9有幾個(gè)關(guān)鍵的區(qū)別，包括:在雙鏈DNA中引起“交錯(cuò)”切割，而不是由Cas9產(chǎn)生的“鈍”切割，依賴于“T rich”PAM(為Cas9提供替代的靶向位點(diǎn))，只需要CRISPR RNA (crRNA)就可以成功靶向。相比之下，Cas9需要crRNA和轉(zhuǎn)錄激活crRNA(tracrRNA)。

? ? ? 這些差異可能使Cas12a比Cas9有一些優(yōu)勢(shì)。例如，Cas12a的小crRNA是多路基因組編輯的理想選擇，因?yàn)榕cCas9的sgRNAs相比，它們可以在一個(gè)載體中封裝更多的crRNA。此外，Cas12a留下的粘稠的5 '懸垂物可以用于DNA組裝，這比傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶克隆更具有靶向性。最后，Cas12a從PAM位點(diǎn)下游切割DNA 18-23個(gè)堿基對(duì)。這意味著在修復(fù)后，識(shí)別序列不會(huì)受到破壞，因此Cas12a能夠進(jìn)行多輪DNA剪切。相比之下，由于Cas9只剪切了PAM位點(diǎn)上游的3個(gè)堿基對(duì)，NHEJ途徑導(dǎo)致了indel突變，破壞了識(shí)別序列，從而防止了進(jìn)一步的剪切。從理論上講，重復(fù)的DNA切割應(yīng)該會(huì)增加所需基因組編輯發(fā)生的機(jī)會(huì)。與Cas9相比，Cas12a的一個(gè)顯著特征是，在切割靶分子后，Cas12a仍然與靶分子結(jié)合，然后不區(qū)分地切割其他ssDNA分子。這種特性被稱為“側(cè)向剪切”或“反向剪切”活動(dòng)，并已被各種診斷技術(shù)的發(fā)展所利用。

Cas13

? ? ? ?2016年，從沙氏纖毛菌(Leptotrichia shahii)中鑒定出核酸酶Cas13a(以前稱為C2c2)。Cas13是一種RNA引導(dǎo)的RNA核酸內(nèi)切酶，這意味著它不能切割DNA，而只能切割單鏈RNA。Cas13被其crRNA引導(dǎo)到一個(gè)ssRNA靶點(diǎn)，并結(jié)合和切割靶點(diǎn)。與Cas12a類似，Cas13仍然與靶蛋白結(jié)合，然后不加區(qū)別地切割其他ssRNA分子。這種間接切割特性已被用于各種診斷技術(shù)的發(fā)展。

基因工程應(yīng)用

? ? ? ?CRISPR的主要應(yīng)用就是基因編輯。

? ? ? CRISPR技術(shù)已被應(yīng)用于食品和農(nóng)業(yè)行業(yè)，以設(shè)計(jì)益生菌，并使工業(yè)培養(yǎng)物(如酸奶)免疫，防止感染。它也被用于農(nóng)作物，以提高產(chǎn)量、抗旱性和營養(yǎng)價(jià)值。

? ? ? ? 常用的CRISPR/Cas系統(tǒng)中，SpCas9來自化膿鏈球菌(Streptococcus Pyogenes)，SaCas9來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)，而BhCas12b V4來自外村尚芽孢桿菌(Bacillus Hisashii)。

? ? ? ?到2014年底，已經(jīng)發(fā)表了大約1000篇提到CRISPR的研究論文。該技術(shù)已被用于使人類細(xì)胞系和細(xì)胞中的基因功能失活，研究白色念珠菌，修改用于制造生物燃料的酵母和轉(zhuǎn)基因作物菌株。Hsu和他的同事說，操縱基因序列的能力允許進(jìn)行反向工程，這可以對(duì)生物燃料的生產(chǎn)產(chǎn)生積極的影響。CRISPR還可以用來改變蚊子，使它們不能傳播瘧疾等疾病?；贑RISPR的利用Cas12a的方法最近已經(jīng)成功地應(yīng)用于大量植物的修飾。

? ? ? ? 2019年7月，CRISPR被用于實(shí)驗(yàn)性治療一名患有遺傳疾病的患者?；颊邽橐幻?4歲的鐮狀細(xì)胞病患者。

? ? ? 2020年2月，在HIV治療方面取得了進(jìn)展，小鼠體內(nèi)整合病毒DNA的60-80%被移除，在經(jīng)過涉及激光抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法和CRISPR的編輯后，一些病毒完全失去了感染性。

? ? ? ?2020年3月，為了治療萊伯先天性黑內(nèi)障，科學(xué)家將CRISPR修飾病毒注射到一位患者的眼睛中。

? ? ? 2021年04月25日，CRISPR-Cas基因修正系統(tǒng)的前驅(qū)之一張鋒教授在《自然》子刊《Nature Communications》發(fā)布一項(xiàng)重要開展，報(bào)告了第三個(gè)可以修正人類細(xì)胞基因組的CRISPR-Cas系統(tǒng)：CRISPR-Cas12b。

? ? ? ? Cas12b(CasC2c1)比Cas9和Cas12a更小，因此更容易經(jīng)過病毒載體完成細(xì)胞間投遞。

? ? ? ? 雖然Cas12b有這樣的優(yōu)勢(shì)，Cas12b的開發(fā)卻遇到了一個(gè)阻撓。功用最佳的Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，但它作為DNA裂解酶的最佳活性需求高達(dá)48℃。也就是說，假設(shè)放進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，達(dá)不到這種Cas12b的溫度要求，酶活性就不能發(fā)揮。怎樣“解鎖”這種Cas蛋白呢？

? ? ? ? 為了適用于人類基因組基因編輯，張鋒教授和伙伴們首先在Cas12b蛋白家族中尋找喜歡常溫的成員。畢竟，根據(jù)同源序列比對(duì)，他們從一種叫作外村尚芽孢桿菌(Bacillus Hisashii)的細(xì)菌中斷定出了在人體體溫(37℃時(shí))能堅(jiān)持核酸酶活性的BhCas12b。并且，研討人員還重新設(shè)計(jì)sgRNA的結(jié)構(gòu)，讓Cas12b如虎添翼。

? ? ? ?體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原始結(jié)構(gòu)的Cas12b在DNA雙鏈斷裂時(shí)會(huì)切開非靶標(biāo)單鏈，并且溫度越低，這種差錯(cuò)發(fā)生得越多。為了處理這個(gè)問題，研討者對(duì)Cas12b進(jìn)行了工程改造。根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的條理，研討人員經(jīng)過4個(gè)點(diǎn)突變，得到了重新設(shè)計(jì)的新Cas12b，讓酶的活性位點(diǎn)更簡略和DNA靶序列靠近。

? ? ? ? 經(jīng)過重新設(shè)計(jì)的Cas12b，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，研討人員針對(duì)多個(gè)基因的多個(gè)靶序列查詢了Cas12b的編輯成功率。對(duì)隨機(jī)引入刺進(jìn)缺失的分析效果閃現(xiàn)，重新設(shè)計(jì)的Cas12b的編輯成功率與Cas9和Cas12a恰當(dāng)、甚至更高，足以在人體細(xì)胞中作為新一代基因編輯工具。

? ? ? ? 除了有效性，特異性關(guān)于一款健壯的基因組修正東西來說也非常重要。這一點(diǎn)，研討團(tuán)隊(duì)也在人類細(xì)胞中運(yùn)用GUIDE-seq技術(shù)對(duì)全基因組規(guī)劃內(nèi)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。效果標(biāo)明，比較常用的Cas9，Cas12b導(dǎo)致的差錯(cuò)刺進(jìn)缺失都要少得多，脫靶性顯著下降。

? ? ? ?未來，CRISPR基因編輯可能被用于創(chuàng)造新物種，或從近親中復(fù)活已滅絕的物種。

? ? ? ?基于CRISPR的對(duì)基因與疾病關(guān)系主張的重新評(píng)估，發(fā)現(xiàn)了潛在的重要異常。

CRISPR診斷

? ? ? ? CRISPR相關(guān)核酸酶已被證明是一種有用的分子檢測(cè)工具，因?yàn)樗鼈兡軌蛟诟弑尘暗姆悄繕?biāo)序列中特異性地靶向核酸序列。2016年，Cas9核酸酶被用于清除下一代測(cè)序文庫中不需要的核苷酸序列，而只需要250皮克的初始RNA輸入。從2017年開始，CRISPR相關(guān)核酸酶也被用于核酸的直接診斷測(cè)試，甚至單分子敏感性。

? ? ? ? 通過將基于CRISPR的診斷技術(shù)與其他酶促過程相結(jié)合，檢測(cè)核酸以外的分子成為可能。這種耦合技術(shù)的一個(gè)例子是基于sherlock的IN體外轉(zhuǎn)錄分析(SPRINT)。SPRINT可用于檢測(cè)多種物質(zhì)，如患者樣本中的代謝物或環(huán)境樣本中的污染物，具有高通量或便攜式即時(shí)護(hù)理設(shè)備。CRISPR/Cas平臺(tái)也正在探索用于檢測(cè)和滅活導(dǎo)致COVID-19的病原體SARS冠狀病毒2。? ? ? ? ? ??? 真核細(xì)胞是由革蘭氏陽性菌進(jìn)化而來，但是為什么屬于革蘭氏陽性菌的葡萄球菌有CRISPR，而真核細(xì)胞沒有CRISPR。

? ? ? ? 附帶一提，少數(shù)病毒，例如米米病毒，也擁有類似CRISPR的免疫系統(tǒng)——MIMIVIRE。它可以切割噬病毒體(Virophage)的DNA，進(jìn)而保護(hù)自己不受傷害。