KRAS基因是人體內(nèi)的一個正常基因，但其突變常發(fā)生在各種類型的腫瘤中，大約有30%的癌癥患者基因組中都存在KRAS基因突變，其中包括90%的胰腺癌，50%的結(jié)腸癌和25%的肺癌。

但KRAS缺乏經(jīng)典的藥物結(jié)合位點，且活化的KRAS蛋白與GTP的結(jié)合具有皮摩爾級親和力，相關(guān)的小分子藥物需要擁有比傳統(tǒng)阻滯劑更強(qiáng)的結(jié)合力才能競爭成功，故用藥物靶向KRAS突變體是件極具挑戰(zhàn)的事。

到目前為止，科學(xué)家針對KRAS做出了很多努力，隨著Amgen公司的KRAS G12C抑制劑（AMG-510）獲得FDA批準(zhǔn)上市，終結(jié)了KRAS不可靶向的“魔咒”，并揭開了KRAS抑制劑研發(fā)的序幕，尋找新的癌癥治療靶點成為越來越多研究者們的課題。當(dāng)然，設(shè)計直接針對KRAS的抑制劑是較難的，所以許多科學(xué)家將精力放在了研究KRAS的上游調(diào)控因子或下游效應(yīng)因子靶向藥的靶點上。

靶向KRAS突變的新藥開發(fā)離不開疾病模型的構(gòu)建，點突變細(xì)胞模型的構(gòu)建能揭示KRAS基因相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)原理，促進(jìn)人類進(jìn)行疾病預(yù)防、新藥開發(fā)和臨床治療，為人類生命健康發(fā)展保駕護(hù)航。下面我們將從目前KRAS靶向藥研發(fā)思路、點突變細(xì)胞在KRAS突變研究上的應(yīng)用案例2個方面展開討論，希望能給大家的研究帶來一些思路。

KRAS基因突變的癌癥治療藥物研究思路

上文有提到用藥物直接靶向KRAS是十分困難的，因此研究人員在過去40年里一直努力找尋相關(guān)間接途徑，并摸索出幾種可行性高的研究思路：包括減少KRAS?的表達(dá)、中斷?KRAS?的膜定位、干擾?KRAS與其效應(yīng)器之間的相互作用，抑制上游和下游信號，以及合成致死方法等，下面就簡單介紹一下目前KRAS靶向藥研發(fā)的常見思路：

1）選擇性抑制KRAS突變

設(shè)計針對KRAS突變具有良好特異性的抑制劑，從而降低KRAS突變體的表達(dá)，從源頭上抑制持續(xù)激活狀態(tài)的KRAS突變體帶來的癌變。

2）抑制法呢?；D(zhuǎn)移酶活性

KRAS蛋白的生物激活需要與膜結(jié)合，通過抑制法呢?；D(zhuǎn)移酶活性可以抑制KRAS蛋白的法呢?；M(jìn)而減少KRAS蛋白定位到細(xì)胞膜上，達(dá)到中斷KRAS膜定位的目的，因此法呢?；D(zhuǎn)移酶也是開發(fā)KARS突變相關(guān)的癌癥治療靶點。

3）設(shè)計針對KRAS-SOS結(jié)合區(qū)域的抑制劑

KRAS的正常激活，需要SOS蛋白參與。因此，另一個靶向藥物的設(shè)計思路是：針對KRAS-SOS結(jié)合區(qū)域設(shè)計靶向抑制劑。

基于“間接途徑”這一突破點，近年陸續(xù)有KRAS抑制劑研發(fā)的好消息——AMG-510的上市，用于治療至少經(jīng)過一次系統(tǒng)治療的KRAS G12C突變的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者；Mirati Therapeutics公司有2款KRAS抑制劑的效用分別在臨床和癌癥模型中得到印證；Revolution Medicines公司也有1款KRAS抑制劑在癌癥模型中表現(xiàn)出良好的抗癌活性。所以科研人員對KRAS的研究熱情也持續(xù)上漲。

KRAS點突變細(xì)胞應(yīng)用案例分析

細(xì)胞模型是人類疾病研究中最常用的工具，可應(yīng)用于靶點驗證、靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)以及藥物篩選等研究，有助于全面認(rèn)識疾病的本質(zhì)，為人類戰(zhàn)勝惡性腫瘤以及開展更深入的研究提供有效手段。下面將分享一些KRAS點突變細(xì)胞在靶點研究上的應(yīng)用案例。

（1）KRASG12C突變對不同信號通路介導(dǎo)的翻譯機(jī)制的影響

在肺癌中檢測到的EGFR(15-50%)或KRAS(20-30%)致癌突變通過激活MAPK和/或PI3K/AKT/mTOR信號通路，這些激活的信號通路靶向重要基因的翻譯起始因子。KRAS主要通過G12、G13和Q61位點的突變導(dǎo)致出現(xiàn)即使在沒有胞外刺激的情況下也發(fā)生異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。KRASG12C是肺腺癌中最常見的致癌突變之一，是一個很有前途的小分子抑制劑治療靶點。KRAS致癌信號通路負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，其中翻譯因子是最顯著的下調(diào)靶點之一。有研究報道，對整合了可誘導(dǎo)的KRASG12C表達(dá)系統(tǒng)的EGFR野生型CL1-5和A549細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CL1-5細(xì)胞中mTORC2和NF-κB參與的cap依賴性翻譯功能受損。而含有KRASG12S突變的A549細(xì)胞可通過招募mTORC1、c-MYC和eIF4F復(fù)合體促進(jìn)cap依賴性的翻譯[2]。通過mTORC1/ p70s6k非依賴性的方式延長KRASG12C的誘導(dǎo)后，CL1-5細(xì)胞的翻譯率得到了恢復(fù)。研究結(jié)果表明KRASG12C信號在不同程度上影響著翻譯機(jī)制的調(diào)節(jié)。這些點突變細(xì)胞株的構(gòu)建以及研究結(jié)果可以為KRAS基因突變的分子機(jī)制和下游表型事件提供更多的參考，并促進(jìn)當(dāng)前KRAS特異性靶向藥開發(fā)提供新的思路。

（2）驗證KRASG12C-G12V雙突變及KRASG12F對G12C特異性抑制劑的抗性[3]

?????KRASG12C共價抑制劑的誕生是RAS突變癌癥治療的重要里程碑，故其對于非小細(xì)胞癌（NSCLC）的治療也意義重大。Vaclova等人對非小細(xì)胞癌中是否存在與G12C突變共發(fā)生的其他KRAS突變、這種共突變是否會影響細(xì)胞對G12C特異性抑制劑（AZ’?8037）的敏感性展開了研究。經(jīng)過對SELECT-1 3期研究（NCT01933932）的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，他們發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞癌中常與G12C突變（c.34G>T）共發(fā)生的突變?yōu)閏.35G>T，而這種共突變有順式和反式兩種情況——順式的共突變會產(chǎn)生G12F突變KRAS蛋白，反式的共突變會產(chǎn)生G12C、G12V兩種突變KRAS蛋白。

而后，為驗證共突變是否會影響G12C特異性抑制劑的效用，Vaclova等人使用CRISPR/Cas9技術(shù)在NSCLC細(xì)胞系中引入c.35G>T突變，構(gòu)建出KRASG12C-G12V雙突變及KRASG12F點突變NCI-H358細(xì)胞，并研究這兩種細(xì)胞對G12C特異性抑制劑的敏感性。結(jié)果顯示，相比于KRAS G12C細(xì)胞系，上述兩種存在共突變情況的細(xì)胞對G12C特異性抑制劑AZ’8037的敏感性顯著下降。

該研究提示人們要對KRAS雙突變的頻率有所重視，應(yīng)進(jìn)行多區(qū)域腫瘤測序避免遺漏KRAS亞克隆突變體，也表明KRAS G12C抑制劑的不足，提示我們KRAS抑制劑研發(fā)仍有一段艱難的路需要走。

盡管幾十年來的研究一直在強(qiáng)調(diào)KRAS突變是腫瘤發(fā)生和臨床耐藥的核心因素，但尚未找到KRAS突變的有效治療方法，對KRAS突變進(jìn)行研究變得迫在眉睫。同樣與癌癥腫瘤相關(guān)且容易突變的熱門激酶基因還有EGFR、BRAF、PIK3CA、MET、NRAS等，目前已經(jīng)有許多研究人員選擇構(gòu)建點突變細(xì)胞模型用于還原基因突變疾病模型，進(jìn)行新藥靶點篩選及驗證。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Huang L, Guo Z, Wang F, Fu L. KRAS mutation: from undruggable to druggable in cancer. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):386.

[2]?Kyriakopoulos, George et al. “KRASG12C Can Either Promote or Impair Cap-Dependent Translation in Two Different Lung Adenocarcinoma Cell Lines.” International journal of molecular sciences vol. 22,4 2222. 23 Feb. 2021, doi:10.3390/ijms22042222

[3]?Vaclova, T., Chakraborty, A., Sherwood, J.?et al.?Concomitant?KRAS?mutations attenuate sensitivity of non-small cell lung cancer cells to KRAS G12C inhibition.?Sci Rep?12, 2699 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06369-3