本文作者：黃宇軒 | 公眾號(hào)：biokiwi

本文關(guān)鍵詞?新型冠狀病毒 穿山甲 蝙蝠 宏基因組

前段時(shí)間華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在媒體報(bào)道中表示，穿山甲可能是潛在的中間宿主，而近日也有來(lái)自其他實(shí)驗(yàn)室的文章報(bào)道了相關(guān)的分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

為什么一定要找到中間寄主？穿山甲會(huì)是中間宿主嗎？希望下面的內(nèi)容可以告訴你答案。

找到中間宿主為什么這么重要？

當(dāng)全國(guó)開(kāi)始返程復(fù)工，湖北省外新冠肺炎感染人數(shù)16連降之時(shí)，全國(guó)的目光都集中在湖北，集中在武漢的疫情戰(zhàn)場(chǎng)，關(guān)注于“特效藥”的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

此時(shí)，我們?yōu)槭裁催€要努力尋找新冠肺炎的中間宿主呢？

首先，我們回憶一下鐘南山院士說(shuō)過(guò)關(guān)于傳染病防治的三大要點(diǎn)：

• 控制傳染源

• 切斷傳播途徑

• 保護(hù)易感人群

前期通過(guò)武漢封城，湖北封省，我們切斷了病毒從湖北向外傳播的途徑；

將確診的非老年輕癥患者收治于方艙，重癥收治于定點(diǎn)醫(yī)院，疑似病例在酒店和寢室隔離，也在一定程度上控制了傳染源，保護(hù)了易感人群（老年人乃至全年齡段）。

但是，請(qǐng)不要忽視，新冠病毒最初肯定是由某種野生動(dòng)物傳染給人。那么，原始的傳染源——野生動(dòng)物如果沒(méi)有找到，就不能實(shí)現(xiàn)真正的完全控制傳染源。

那為什么會(huì)存在中間宿主？

這次新冠病毒的爆發(fā)和03年的SARS有很多相似之處，所以當(dāng)初的很多經(jīng)驗(yàn)也可以借鑒。

2003年4月份，很多研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)始尋找SARS的動(dòng)物宿主；
5月8日和9日，管軼帶領(lǐng)學(xué)生在深圳市東門(mén)市場(chǎng)取了25對(duì)標(biāo)本，包括8種動(dòng)物，其中果子貍?cè)×?個(gè)樣本；
直到5月18日凌晨，管軼和學(xué)生才拼接出果子貍中病毒的基因組序列，與SARS具有99.8%的同源性；
又經(jīng)過(guò)一些波折，12月24日，廣州發(fā)現(xiàn)一例新的SARS疑似病例；
直到2004年1月，才開(kāi)始清剿果子貍的行動(dòng)。

中間宿主的清剿，有效遏制了SARS的再次爆發(fā)。

但直到2017年年底，中科院武漢病毒所的石正麗團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)多年的野外標(biāo)本采集和鑒定才證實(shí)，SARS病毒的原始宿主是蝙蝠。

再看回2020年的新冠病毒。

得益于測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，加上科研人員多年的基礎(chǔ)研究和數(shù)據(jù)積累，我們?cè)?strong>短短6小時(shí)，即通過(guò)高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新型肺炎病毒和SARS病毒相類(lèi)似。

并通過(guò)分離培養(yǎng)和鑒定，在1月初發(fā)現(xiàn)該病毒基因組與已知的SARS病毒同源性高達(dá)96%（下文稱(chēng)此病毒為RaTG13-CoV）。

所以科研人員鎖定該病毒的原始宿主為蝙蝠。

華南海鮮市場(chǎng)是否售賣(mài)蝙蝠尚無(wú)明確證據(jù)，而即使是96%的相似程度，也仍和新冠病毒有較大的差異，因此我們認(rèn)為新冠肺炎病毒很可能存在一個(gè)蝙蝠和人的中間宿主。

如何尋找中間宿主？

現(xiàn)在大多數(shù)生物學(xué)研究，都需要“干濕結(jié)合”，也就是既需要實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，也需要前期的數(shù)據(jù)挖掘和后期生物信息學(xué)分析。

順著這條思路，科研人員也兵分兩路，去探尋新冠病毒的中間宿主。

華南海鮮市場(chǎng)至少于12月底、1月初、1月中旬進(jìn)行過(guò)3次采樣，從目前已披露的信息得知，12月底并未檢測(cè)出類(lèi)似SARS的病毒，1月份的環(huán)境樣本中則有大量樣本檢測(cè)出新冠病毒基因組序列，然而能否溯源到具體的野生動(dòng)物暫時(shí)還不得而知。

“濕”的路徑受到了阻礙，很多科學(xué)家開(kāi)始關(guān)注于“干實(shí)驗(yàn)”——生物信息學(xué)分析。

很快有文獻(xiàn)從密碼子偏好性方面分析，中間宿主可能來(lái)自于蛇。

但是冬天蛇往往在冬眠，且蛇是爬行動(dòng)物，與人的基因組相差較大，這個(gè)可能也因此飽受質(zhì)疑。

科學(xué)家們轉(zhuǎn)而開(kāi)始利用“大數(shù)據(jù)”分析潛在的中間宿主。

科學(xué)家基于對(duì)SARS病毒的研究基礎(chǔ)，認(rèn)為新冠肺炎病毒也具有Spike蛋白，這是冠狀病毒包膜上的一種刺突糖蛋白，普遍認(rèn)為能結(jié)合宿主的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2 ，ACE2)，從而介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，讓病毒入侵細(xì)胞。

既然病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞才能復(fù)制增殖，而進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵就是spike蛋白，如果其他病毒有相似的spike蛋白，那么他們可能就有一定的關(guān)系。

通過(guò)比對(duì)進(jìn)入細(xì)胞的鑰匙——Spike蛋白的基因序列，科學(xué)家們就能更準(zhǔn)確地找到新冠病毒可能的“近親”。

科學(xué)家們使用的“武器”——大數(shù)據(jù)，其實(shí)就是前文提到的宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。

宏基因組是指一個(gè)特定樣品中所有物種的基因組，不局限于人體，也有動(dòng)物，植物和土壤等等。這就好像一個(gè)大鍋燉，把所有的基因序列全部測(cè)了，之后再分析里面具體有什么。

這次新冠病毒的發(fā)現(xiàn)，最早也是基于宏基因組，利用mNGS技術(shù)組裝出病毒的基因組草圖才能最終確定其身份。

同樣地，為了找到新冠病毒的“近親”，科研人員于一月初通過(guò)深度測(cè)序，組裝出新冠病毒的精確基因組序列。但是可供參考的宏基因組中，基因序列都是草圖，大多都是不完整的小片段，難以直接進(jìn)行比對(duì)。

令人慶幸的是，在2019年10月，來(lái)自廣東應(yīng)用生物資源研究所的科研人員發(fā)表了一篇題為Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)的論文。文章中發(fā)布了其組裝的馬來(lái)西亞穿山甲體內(nèi)的病毒宏基因組草圖。

雖然草圖中不會(huì)包含所有得到的基因序列，但很幸運(yùn)的包含了Spike蛋白的RBD（受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域）。

由于已知新冠病毒的受體蛋白ACE2主要在肺中表達(dá)，有人就利用來(lái)自穿山甲肺部的宏基因組序列，結(jié)合VirMAP軟件，組裝出穿山甲肺部冠狀病毒的基因組草圖；并驚奇地發(fā)現(xiàn)部分序列和新冠病毒的S蛋白基因序列高度相似，不管是從序列比對(duì)、系統(tǒng)關(guān)系還是蛋白結(jié)構(gòu)都非常相似。

那么，基于此我們能不能說(shuō)穿山甲就是中間宿主呢？

答案依舊是否定的。

一方面我們不知道穿山甲冠狀病毒的全基因組序列，僅僅通過(guò)RBD結(jié)構(gòu)域的分析還十分有限；

另一方面缺少流行病學(xué)的證據(jù)，無(wú)法進(jìn)行因果分析。

只不過(guò)最近又出現(xiàn)了一些相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，似乎能為這個(gè)假說(shuō)提供更多證據(jù)。

Matthew C. Wong和Lamia Wahba等人都在預(yù)印本平臺(tái)BioRxiv上發(fā)布文章，討論了基于病毒宏基因組比對(duì)到穿山甲冠狀病毒的RBD結(jié)構(gòu)域序列，但仍然存在一定的局限性。

其中線(xiàn)越靠上說(shuō)明和新冠病毒越相似，大體上藍(lán)色最相似，但是聚焦到spike蛋白的RBD區(qū)域時(shí)卻是穿山甲更相似，這里也是人們關(guān)注的地方。

而關(guān)于穿山甲體內(nèi)的冠狀病毒，也開(kāi)始了此前尚未成功的濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2020年2月中旬，香港大學(xué)的管軼教授和廣西醫(yī)科大學(xué)的胡艷玲老師等人合作，基于前面的大數(shù)據(jù)研究基礎(chǔ)，收集了廣西海關(guān)查獲的18個(gè)冷凍穿山甲組織樣品。在腸和肺的混合樣品中，成功分離出冠狀病毒。

作者組裝出穿山甲冠狀病毒的基因組草圖，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該冠狀病毒與SARS病毒具有很高的同源性。

但是其與新冠病毒的同源性不如RaTG13-CoV。

針對(duì)RBD結(jié)構(gòu)域的分析也得到了類(lèi)似的結(jié)果。

特別值得注意的是，新冠病毒和廣東來(lái)源的穿山甲的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間氨基酸序列的相似性高達(dá)97.4%。

只是不知道這批穿山甲和Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)文獻(xiàn)中的是不是同一批。

有意思的是，幾乎在同一天，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員也在GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中上傳了穿山甲冠狀病毒的基因組數(shù)據(jù)。

系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析顯示出與管軼教授類(lèi)似的結(jié)果：總體和現(xiàn)在的新冠病毒很像，但還是不如RaTG13-CoV相似性高。

最后我們做個(gè)簡(jiǎn)單總結(jié)：

基于病毒宏基因組的數(shù)據(jù)、熒光定量PCR、分離純化病毒并培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以確認(rèn)在穿山甲中存在冠狀病毒，且該冠狀病毒的基因組與新冠病毒高度相似。

盡管兩者總體相似性在85.5%-92.4%，但是來(lái)源于廣東的穿山甲的冠狀病毒的RBD結(jié)構(gòu)域與新冠病毒相似度高達(dá)97.2%，是高于蝙蝠冠狀病毒RaTG13-CoV的。

但是，目前還未發(fā)現(xiàn)任何來(lái)自潛在中間寄主的冠狀病毒，相較于蝙蝠來(lái)源的RaTG13-CoV，和新冠病毒基因組的整體更加相似。

而出現(xiàn)局部RBD的結(jié)構(gòu)域相似度更高，也可能是因?yàn)?strong>趨同演化的原因，并不能說(shuō)明廣東來(lái)源的穿山甲冠狀病毒與新冠病毒有最近的親緣關(guān)系。

換句話(huà)說(shuō)，就是穿山甲可能是新冠病毒的潛在中間宿主，但還不能確認(rèn)是中間宿主。

最后十分期待華南農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于穿山甲為新冠病毒中間宿主的論文，也期待科學(xué)家們對(duì)于病毒來(lái)源的問(wèn)題有更進(jìn)一步的探究結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]?http://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7_reference.pdf

[2] Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)

[3] Evidence of recombination in coronaviruses implicating pangolin origins of nCoV-2019 Matthew C. Wong, Sara J. Javornik Cregeen, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino bioRxiv 2020.02.07.939207; doi:?https://doi.org/10.1101/2020.02.07.939207

[4]Identification of a pangolin niche for a 2019-nCoV-like coronavirus through an extensive meta-metagenomic search Lamia Wahba, Nimit Jain, Andrew Z Fire, Massa J Shoura, Karen L Artiles, Matthew J McCoy, Dae Eun Jeong bioRxiv 2020.02.08.939660; doi:?https://doi.org/10.1101/2020.02.08.939660

[5]Identification of 2019-nCoV related coronaviruses in Malayan pangolins in southern China Tommy Tsan-Yuk Lam, Marcus Ho-Hin Shum, Hua-Chen Zhu, Yi-Gang Tong, Xue-Bing Ni, Yun-Shi Liao, Wei Wei, William Yiu-Man Cheung, Wen-Juan Li, Lian-Feng Li, Gabriel M Leung, Edward C Holmes, Yan-Ling Hu, Yi Guan bioRxiv 2020.02.13.945485; doi:?https://doi.org/10.1101/2020.02.13.945485

[6] 《管軼教授口述：2003年港大實(shí)驗(yàn)室是如何鎖定SARS源頭的？》，三聯(lián)生活周刊，2013年第10期

[7]?http://virological.org/t/ncov-