Di 屬于長鏈二烷基碳菁類染料，因其獨特的結(jié)構(gòu)使其具有極強(qiáng)親脂性，可與脂溶性生物結(jié)構(gòu)結(jié)合，在一定濃度下，可以對細(xì)胞膜進(jìn)行完全染色。Di 染料被激發(fā)后具有很高的淬滅系數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命，在細(xì)胞與組織定位示蹤中起到了極大作用。

DiD（CAS：127274-91-3），DiO（CAS：34215-57-1），DiI（CAS：41085-99-8），DiR（CAS：100068-60-8）和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，這類染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。一旦對細(xì)胞染色，這類染料在整個細(xì)胞膜上擴(kuò)散，佳濃度時可以使整個細(xì)胞膜染色。它們的熒光顏色區(qū)分明顯：DiI(橙色熒光)，DiO(綠色熒光)，DiD(紅色熒光)和 DiR (深紅色熒光)這使得他們可以用來對活細(xì)胞進(jìn)行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長，在細(xì)胞和組織染色中更有價值。 DiR的紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，在活體成像中用來示蹤。

常見的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激發(fā)后形成不同顏色的熒光 (如圖 1)。

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■?DiO 染色為例，簡要拋出體外實驗步驟

a）接種適量數(shù)目的細(xì)胞，37°C 培養(yǎng)過夜。

b）去除培養(yǎng)基，離心收集細(xì)胞，加入 PBS 洗滌 2-3 次，每次 5 分鐘。

c）加入對應(yīng)濃度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室溫孵育 30 分鐘。

d）400 g，4℃ 離心 3-4 分鐘，棄去上清。再次加入 PBS 洗滌細(xì)胞 2-3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DiO。

f）用無血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞后，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下檢測。

■?DiO

DiO 為綠色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織。(但相較其他三種染料，DiO?染料熒光強(qiáng)度較弱，對于某些固定的組織切片染色效果略差)。

Xin Li 等人研究了 CPCs (心臟祖細(xì)胞) 衍生的外泌體 (CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信號通路來減少病毒性心肌炎的細(xì)胞凋亡。研究人員用 DiO 對 CPCs-Ex 進(jìn)行標(biāo)記?(Dio 可通過選擇性分割被納入細(xì)胞膜)，評估 H9C2 細(xì)胞對 CPCs-Ex 的體外攝取，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)?H9C2?細(xì)胞的每個細(xì)胞質(zhì)均包含熒光信號 (圖 2)，并減少 H9C2 細(xì)胞的凋亡，確定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染細(xì)胞中的抗凋亡作用。

■?DiI

DiI 為橙紅色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織，熒光信號強(qiáng)度高于 DiO，在進(jìn)入細(xì)胞膜時，其熒光信號會被大幅度放大。

如圖 4 所示，Dil 染料標(biāo)記外泌體，然后與目標(biāo)細(xì)胞共培養(yǎng)。使用共聚焦顯微鏡捕捉 HOS 細(xì)胞對 Dil 標(biāo)記外泌體的攝取，其中被標(biāo)記的外泌體發(fā)出特異性橙紅色熒光。

■?DiD

DiD 為一種紅色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 646/663 nM，DiD 熒光信號高、不易淬滅、自身熒光干擾低，不僅用于細(xì)胞/組織染色，小動物活體成像中是最常用的。

Yuxuan Fu 等人研究出一種藥物傳輸方法來達(dá)到抗新冠藥物更好的進(jìn)入靶器官的目的，研究者使用?DiD?標(biāo)記細(xì)胞外小泡 (EV) 病毒蛋白的受體結(jié)合域 (EV-RBD) ，并進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，通過熒光成像可以看到，信號主要在心臟、肺、腎臟中聚集，并且值得注意的是，在 96 h 時，標(biāo)記的 EV-RBD 累積的熒光信號仍保留在肺組織中，這證明了該方法的可行性。

■?DiR

DiR 是一種近紅外染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 754/778 nm，用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織，與 DiD 一樣，DiR 自身熒光背景較低，也被用在活體成像中。

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