胰腺導管腺癌（PDAC）是最致命的消化道惡性腫瘤之一，由于早期缺乏特異性癥狀，約82%的PDAC患者在診斷時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此失去了最佳手術(shù)機會。此外，由于PDAC具有極強的頑固性，即使在根治性切除術(shù)后，仍有75%的患者在5年內(nèi)死于復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。因此，研發(fā)有效的PDAC早期診斷生物標志物和有效的治療策略迫在眉睫。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類單鏈閉環(huán)的RNA分子，由前體mRNA反向剪接或外顯子跳躍形成。因其具有穩(wěn)定性、豐度和進化保守性，circRNA在細胞功能中起著重要作用。越來越多研究表明，circRNA以各種方式影響癌癥的進展，例如作為miRNA海綿、蛋白質(zhì)誘餌、circRNA-蛋白質(zhì)復合物支架和翻譯模板。然而，大多數(shù)circRNA的確切功能仍然模糊不清，需要更多研究來挖掘其潛能。

2023年9月9日，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院孫備和胡繼盛教授團隊在Molecular Cancer(IF=37.3)發(fā)表文章"circEIF3I facilitates the recruitment of SMAD3 to early endosomes to promote TGF-β signalling pathway-mediated activation ofMMPs in pancreatic cancer"。作者通過分析PDAC組織中circRNA的微陣列數(shù)據(jù)，鑒定了源自EIF3I基因的circEIF3I，發(fā)現(xiàn)circEIF3I在PDAC組織中上調(diào)且與預后不良有關(guān)，而circEIF3I的下調(diào)則顯著抑制了胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。circEIF3I通過與SMAD2和AP3A2的MH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合來作為分子支架，促進SMAD3向早期內(nèi)體上的TGFβR1富集，從而激活TGF-β信號通路促進胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制。該研究表明，circEIF3I是一種潛在的生物標志物，可用于預測轉(zhuǎn)移和不良預后，靶向circEIF3I能阻止PDAC進展。

circEIF3I在PDAC中高表達，與預后不良相關(guān)

首先，作者通過對PDAC和相鄰正常組織進行circRNA轉(zhuǎn)錄組差異分析，發(fā)現(xiàn)有16個circRNA的表達發(fā)生顯著變化（其中有15個上調(diào)和1個下調(diào)的circRNA）；經(jīng)過qRT-PCR驗證后，發(fā)現(xiàn)circEIF3I（hsa_circ_100146）是PDAC組織中唯一顯著上調(diào)的circRNA。此外，較高的circEIF3I表達與晚期臨床階段有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PDAC組織中circEIF3I上調(diào)，表明circEIF3I可能與腫瘤細胞侵襲能力相關(guān)。生存曲線表明PDAC中circEIF3I高表達與預后不良相關(guān)。

circEIF3I的鑒別和特征

經(jīng)過序列檢索，鑒定circEIF3I來源于位于人類3號染色體上的EIF1I基因，由外顯子6和7反向剪接產(chǎn)生。作者運用背靠背引物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)合RNase R耐受性檢測實驗，表明circEIF3I的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相對更穩(wěn)定，而EIF2I和GAPDH mRNA轉(zhuǎn)錄本被降解。經(jīng)過放線菌素D處理后，circEIF2I的半衰期遠比線性轉(zhuǎn)錄本的半衰期更長，表現(xiàn)出circEIF3I的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。FISH結(jié)果表明，circEIF3I主要定位于細胞質(zhì)中。

circEIF3I在體外促進胰腺癌細胞遷移侵襲，并在體內(nèi)促進轉(zhuǎn)移

作者設計特異性siRNA對circEIF3I進行敲低，再建立shRNA的穩(wěn)定細胞株，并對敲低后和正常組的PANC-1細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)敲低circEIF3I抑制了膠原蛋白降解通路和細胞外基質(zhì)降解通路基因的表達，表明circEIF3I可能參與胰腺癌轉(zhuǎn)移表型的調(diào)控，與對應的臨床樣本數(shù)據(jù)一致。細胞功能實驗顯示，敲低circEIF3I顯著降低了PANC-1和BxPC-3細胞的遷移和侵襲能力，并且在穩(wěn)定細胞株中獲得相同的結(jié)果。通過小鼠體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)sh-circEIF3I組的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量遠低于sh-ctrl組，這與體外表型結(jié)果一致。然而，原位腫瘤大小在circEIF3I敲低組和對照組之間沒有顯著差異。但是，circEIF3I過表達增強了 PANC-1 and BxPC-3細胞在體外實驗中的遷移和侵襲能力，而且在小鼠體內(nèi)形成了更多的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量?？傊?strong>這些結(jié)果表明circEIF3I在體外促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲，并在體內(nèi)促進轉(zhuǎn)移。

circEIF3I通過增強MMP活性來促進癌細胞侵襲和遷移

作者運用熱圖分析與“膠原蛋白降解”途徑相關(guān)的富集基因的表達譜，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的轉(zhuǎn)錄水平降低。在PANC-4和BxPC-1細胞中，通過qRT-PCR和WB從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分別證實，敲低circEIF3I會導致MMP相關(guān)基因和蛋白表達下調(diào)，而過表達circEIF3I則帶來相反的結(jié)果。同時，作者通過明膠酶譜法評估MMP的活性，發(fā)現(xiàn)敲低circEIF3I會使MMP活性降低，而過表達circEIF3I則增強其活性。因此，以上表明circEIF3I通過增加胰腺癌細胞中MMP相關(guān)基因的表達和活性來促進其侵襲和轉(zhuǎn)移。

circEIF3I直接與SMAD3結(jié)合并增加SMAD3磷酸化

作者通過調(diào)研和生信分析，排除了circEIF3I的miRNA海綿作用和翻譯功能，于是運用MS2-TRAP技術(shù)來檢測circEIF3I是否結(jié)合蛋白質(zhì)。該實驗主要依賴于帶MS2標記的circEIF2I過表達技術(shù)，主要通過MS2標簽與融合蛋白MS2-GST的高親和力相互作用來捕獲細胞裂解物中的circEIF2I結(jié)合蛋白。作者通過qRT-PCR和Sanger測序驗證了MS2-circEIF3I質(zhì)粒在靶細胞中過表達并正確環(huán)化，再通過磁珠介導的捕獲高度富集circEIF3I，最后運用銀染和質(zhì)譜分析下拉的蛋白質(zhì)。接著，作者通過RIP實驗證實，circEIF3I與SMAD3具有特異性結(jié)合作用。此外，F(xiàn)ISH-IF分析結(jié)果顯示，circEIF3I與SMAD3共定位于細胞質(zhì)中。

更重要的是，作者運用構(gòu)建四個不同的帶HA標簽載體來識別SMAD3蛋白的哪個結(jié)構(gòu)域與circEIF3I相互作用，通過RIP實驗和pull-down技術(shù)證實，circEIF3I與SMAD3的MH2結(jié)構(gòu)域相互作用。接著，作者還通過WB和IHC實驗發(fā)現(xiàn)，抑制或過表達circEIF3I會導致磷酸化SMAD3（p-SMAD423 Ser423/425）的降低或增加而不影響SMAD3的總體表達，表明circEIF3I可能調(diào)節(jié)SMAD3磷酸化水平而不是SMAD3表達水平。而且，ISH實驗和H-score結(jié)果顯示，circEIF3I表達與pSMAD3和MMP表達呈正相關(guān)。綜上表明，circEIF3I直接與SMAD3結(jié)合并促進其磷酸化，從而導致MMP表達上調(diào)。

circEIF3I促進SMAD3在早期內(nèi)體上募集到TGFβRI

作者通過CO-IP實驗發(fā)現(xiàn)，敲低circEIF3I會破壞SMAD3與TGFβRI之間的相互作用；IF結(jié)果表明，敲低circEIF3I使SMAD3和TGFβRI的共定位效果減弱，表明circEIF3I會促進SMAD3招募到TGFβRI。為了探討由circEIF3I介導的SMAD3磷酸化是否發(fā)生在細胞膜或早期內(nèi)體上，作者使用Dyngo-4a動力蛋白抑制劑來阻斷TGF-β受體內(nèi)吞作用，通過WB和IF檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過circEIF3I增加的p-SMAD3水平在內(nèi)吞作用被抑制后顯著降低，而且敲低circEIF3I后會使位于早期內(nèi)體上的SMAD3水平降低。綜上表明，circEIF3I介導的SMAD3和TGFβRI互作主要發(fā)生在早期內(nèi)體上，而不是在細胞膜上。

circEIF3I通過與AP2A1結(jié)合促進SMAD3募集到早期內(nèi)體

作者發(fā)現(xiàn)circEIF3I不直接與TGFβRI結(jié)合，因此推測另一種蛋白質(zhì)AP2A1結(jié)合circEIF3I并促進SMAD3在早期內(nèi)體上與TGFβRI互作，這在pull-down和質(zhì)譜結(jié)果中得到了證實。接著，作者運用了一系列實驗如co-IP、WB和IF共同驗證了AP2A1與circEIF3I和SMAD3互作并增強circEIF3I誘導的SMAD3磷酸化。此外，作者通過分子對接技術(shù)和蛋白實驗進一步證實了SMAD3的MH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂ccircEIF3I互作至關(guān)重要?？傊陨习l(fā)現(xiàn)表明，circEIF3I與SMAD3和AP2A1一起充當分子支架，形成三元復合物，促進SMAD3募集到早期內(nèi)體，激活TGF-β信號通路。

小鼠中的同源circEIF3I具有相似的生理功能

作者通過circBank數(shù)據(jù)庫在小鼠中發(fā)現(xiàn)了circEIF3I的同源序列并將其命名為circEif3i，并進一步驗證其生理功能是否具有保守性。首先通過背靠背引物驗證、RNase R耐受性測試和放線菌素D處理，驗證了circEif3i的環(huán)狀結(jié)構(gòu)比其線性形式更穩(wěn)定且半衰期更長。此外，作者運用特異性靶向circEif3i的shRNA載體建立了穩(wěn)定細胞株，并建立了小鼠模型。實驗結(jié)果顯示，sh-circEif3i組的腸道、腸系膜和肝臟中的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)比對照組少，而原位腫瘤體積無顯著差異，表明小鼠circEif3i通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路促進胰腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與人類circEIF3I具有相似的生理功能。

小結(jié)：

本文深入研究了circRNA作為蛋白支架的分子機制，其中運用到MS2-TRAP技術(shù)進行蛋白下拉實驗，該技術(shù)優(yōu)勢在于不依賴細胞內(nèi)circRNA的本底表達水平，對細胞內(nèi)表達豐度低的circRNA同樣適用。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s12943-023-01847-2

引用文獻：

[1] Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, Jemal A. Cancer statistics, 2021. CA Cancer J Clin. 2021;71:7–33.