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盤(pán)點(diǎn)常用的分子互作實(shí)驗(yàn)！

2023-09-22 14:01 作者:南京福麥斯生物 0人讀過(guò) | 我要投稿

在探索不同分子機(jī)制的時(shí)候，需要用到不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行反復(fù)論證。

目前高分雜志對(duì)于文章的創(chuàng)新性和機(jī)制深度的要求越來(lái)越高，除了經(jīng)典的qPCR和WesternBlot方法外，新的技術(shù)越來(lái)越多的被應(yīng)用到各類(lèi)相關(guān)文章中！今天盤(pán)點(diǎn)下“直接機(jī)制”中的分子互作實(shí)驗(yàn)！

分子間互作實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型

根據(jù)作用的分子類(lèi)型（DNA、RNA和蛋白），可以將分子間互作分為以下：

①蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)：如免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀(CO-IP)、GST pull-down、Far-Western Blotting

②蛋白質(zhì)-RNA：如RIP、RNA pull down

③蛋白質(zhì)-DNA：如染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)

④蛋白質(zhì)-DNA/RNA：如凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)

⑤RNA-DNA：如熒光素酶實(shí)驗(yàn)（Luciferase Assay）

一、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)

1.免疫沉淀（IP）

免疫沉淀IP 是利用抗體特異性反應(yīng)富集純化目的蛋白的一種方法，可用于目的蛋白的定性和定量分析。是用于抗原檢測(cè)和純化的最廣泛使用的方法之一。

免疫沉淀（IP）的原理為：

IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G”特異性的結(jié)合到抗體（免疫球蛋白）的Fc片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。

實(shí)驗(yàn)步驟：

針對(duì)特定靶蛋白的抗體與樣品（細(xì)胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫復(fù)合物，隨后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠將該免疫復(fù)合物從混合物中沉淀下來(lái)。

2.免疫共沉淀(CO-IP)

Co-IP是免疫沉淀（IP）的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用檢測(cè)。是一種以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究體內(nèi)(in vivo)蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用。

Co-IP的原理：

基于IP反應(yīng)捕獲和純化靶蛋白，如果樣品溶液中存在與靶蛋白相互作用的目的蛋白，也會(huì)被一同捕獲及純化得到，隨后利用SDS-PAGE、Western Blot等手段對(duì)得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析。

免疫共沉淀的優(yōu)勢(shì)：

與其它研究方法相比，該體系是在生理?xiàng)l件下檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此，不僅可以檢測(cè)到體內(nèi)形成的天然復(fù)合體，而且可排除過(guò)表達(dá)靶蛋白所帶來(lái)的假陽(yáng)性。其次內(nèi)源性的靶蛋白質(zhì)是完全加工、修飾和成熟的蛋白質(zhì)，因此，依賴(lài)于修飾的蛋白質(zhì)相互作用也能被檢測(cè)到。

3.GST pull-down

GST-pulldown技術(shù)主要用于研究體外強(qiáng)烈或者穩(wěn)定的蛋白質(zhì)間相互作用，可以驗(yàn)證兩種已知的蛋白質(zhì)可能存在的直接相互作用或者尋找可能與目標(biāo)蛋白存在相互作用關(guān)系的未知靶蛋白，且體外驗(yàn)證蛋白直接相互作用時(shí)有較強(qiáng)的特異性。

GST pull-down的基本原理：

將靶蛋白-GST 融合蛋白親和固化在谷胱甘肽瓊脂糖磁珠上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶與之孵育，從而捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離，最后經(jīng)western blot 或質(zhì)譜分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用。

補(bǔ)充：co-IP 和GST pull-down區(qū)別

①co-IP：研究的是體內(nèi)自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)互相作用，反應(yīng)的是比較真實(shí)的蛋白質(zhì)相互作用，由于沉淀下來(lái)的是蛋白質(zhì)復(fù)合物，不能顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用是直接還是間接的。

②GST pull down：可以確定目的蛋白和檢測(cè)蛋白是否發(fā)生直接相互作用，但是無(wú)法得知體內(nèi)真實(shí)的結(jié)合情況。

4.Far-Western Blotting

Far-western blotting 該技術(shù)是由 Western blotting 衍生而來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，是一種體外（in vitro）檢測(cè)蛋白間相互作用的分子生物學(xué)方法。它可以驗(yàn)證已知蛋白間的相互作用，或分析已知蛋白和未知蛋白間的相互作用。由于該方法靈敏度較高，現(xiàn)已得到廣泛的應(yīng)用。

在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，用特異性抗體（一抗）去檢測(cè)膜上的蛋白，HRP標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，通過(guò)顯影觀察膜上的蛋白。而在Farwesternblot中，將靶蛋白固定在PVDF/NC膜上，用誘餌蛋白(已知蛋白）作為探針去檢測(cè)膜上的靶蛋白，再利用特異性抗體孵育、檢測(cè)，以此來(lái)分析靶蛋白和誘餌蛋白間的相互作用。

Far-westernblot實(shí)驗(yàn)流程主要包括：凝膠電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-孵育-檢測(cè)，如下圖所示。

二、蛋白質(zhì)-RNA

1.RIP

RIP是一種RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)，用于檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用，以蛋白為主角。

RIP的基本原理：

用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái)，結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip）、定量RT-PCR或高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。

2.RNA pull down

RNA pull-down 作為研究 RNA 與蛋白互作的核心技術(shù)，已成為研究焦點(diǎn)，是近年來(lái)研究IncRNA、circRNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要手段。其以RNA為主角，研究其與蛋白的互作。

RNA pulldown的基本原理：

使用體外轉(zhuǎn)錄與生物素標(biāo)記RNA，然后與細(xì)胞或組織的提取液進(jìn)行孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，通過(guò)磁分離與孵育液中的其他成份分離。再利用游離生物素競(jìng)爭(zhēng)洗脫復(fù)合物，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的蛋白是否與RNA相互作用，或者運(yùn)用質(zhì)譜篩選RNA結(jié)合的未知蛋白。

三、蛋白質(zhì)-DNA

1.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

CHIP是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法，CHIP又分為CHIP-qPCR（已知蛋白和靶序列）和CHIP-seq（已知蛋白和未知序列）。CHIP應(yīng)用于檢測(cè)與蛋白結(jié)合的DNA序列，常用于研究轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾。并且CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。

染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)的原理：

在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

四、蛋白質(zhì)-DNA/RNA

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是分子生物學(xué)中一種應(yīng)用廣泛的研究DNA結(jié)合蛋白和其識(shí)別基序（motif）直接相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于蛋白-DNA互作，目前也被用于研究蛋白—RNA互作。

EMSA技術(shù)主要基于蛋白-探針（DNA或RNA）復(fù)合物在在凝膠電泳過(guò)程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物。

這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒(méi)有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會(huì)在膜靠前的位置形成一條帶，說(shuō)明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)生互作。

EMSA實(shí)驗(yàn)可分為三個(gè)主要部分，分別是蛋白制備、探針制備、凝膠實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)原理看似簡(jiǎn)單，但步驟繁雜且假陽(yáng)性與假陰性率均較高，針對(duì)不同蛋白需要仔細(xì)摸索最適實(shí)驗(yàn)條件，才會(huì)得到漂亮的且可穩(wěn)定重復(fù)的結(jié)果。

1.RNA-DNA

Luciferase

熒光素酶實(shí)驗(yàn)（Luciferase Assay）通常用來(lái)檢測(cè)蛋白-蛋白及蛋白-基因之間的相互結(jié)合，如轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制，啟動(dòng)子的活性驗(yàn)證及蛋白分子之間相互作用等。與其他方法相比，熒光素酶實(shí)驗(yàn)不需要顯微鏡級(jí)別的檢測(cè)儀器和嚴(yán)苛的檢測(cè)環(huán)境，就能夠?qū)ν暾M織進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、實(shí)時(shí)定量。

熒光素酶(Luciferase)的基本原理：

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性?？蓪⒑ＤI熒光素酶基因的質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。

熒光素酶(Luciferase)的原理：

①啟動(dòng)子活性研究：