期刊：Frontiers in Molecular Neuroscience

影響因子：6.2610

導(dǎo)讀

在2.46億糖尿病患者中，大約三分之一有糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)的跡象。DR的發(fā)病機制非常復(fù)雜，尚未完全闡明，其基本病理變化是血視網(wǎng)膜屏障(blood retina barrier, BRB)的破壞和視網(wǎng)膜新生血管的形成。

科學(xué)問題

由于參與視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量眾多，細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)機制復(fù)雜，血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(inner BRB, iBRB)在DR早期損傷的機制尚不完全清楚，其探索仍然是一個重大挑戰(zhàn)。

研究技術(shù)

scRNA-seq，免疫熒光

（部分技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）

方法

本研究主要使用了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(scRNA-seq)，使用了5個大鼠視網(wǎng)膜樣本（2只正常SD大鼠；3只DR大鼠，在造模2周、4周和8周各1只），總共檢測35,910個轉(zhuǎn)錄本，探討了DR早期iBRB損傷的細(xì)胞機制。

結(jié)論

本文探索了周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和兩種繆勒氏細(xì)胞亞型的特征，并在DR早期構(gòu)建了它們之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果再次強調(diào)了iBRB的重要作用，為保護(hù)iBRB和抑制DR的進(jìn)一步發(fā)展提供了有潛力新的靶點，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和社會價值。

研究路線圖

研究結(jié)果

1. 血液-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(iBRB)中細(xì)胞類型圖譜

為了模擬早期DR，實驗使用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)在大鼠中構(gòu)建2型糖尿病模型。實驗剝離了5只大鼠的視網(wǎng)膜(2只正常大鼠；3只用STZ處理大鼠，每只分別處理2周、4周和8周)，對組織進(jìn)行解離稀釋并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。質(zhì)控過濾后，保留了35,910個高質(zhì)量細(xì)胞：11,073個來自正常樣本；24,837個來自糖尿病大鼠樣本。將聚類分群的33個cluster分為10種細(xì)胞類型，可概括為兩大類別包括：血液來源的巨噬細(xì)胞類群和視網(wǎng)膜駐留細(xì)胞類群。其中視網(wǎng)膜駐留細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞(棒細(xì)胞、錐細(xì)胞、視網(wǎng)膜水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞和雙極細(xì)胞)、膠質(zhì)細(xì)胞(繆勒氏細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞。基于CellChat分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和繆勒氏細(xì)胞比其他細(xì)胞具有更復(fù)雜的通信模式。此外，本文計數(shù)了正常大鼠和糖尿病大鼠中不同細(xì)胞群差異表達(dá)基因數(shù)量(differentially expressed genes, DEGs)，結(jié)果顯示構(gòu)成iBRB的細(xì)胞：繆勒氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞在DR早期發(fā)生顯著改變。GO富集分析顯示，這三種細(xì)胞類型都與血管的形成和增殖、缺氧和細(xì)胞粘附有關(guān)。周細(xì)胞顯示與血管收縮相關(guān)，而繆勒氏細(xì)胞與神經(jīng)元的形成和發(fā)育有關(guān)。

2. 繆勒氏細(xì)胞兩種亞型的特征

在DR的早期，繆勒氏細(xì)胞損傷可導(dǎo)致視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)的破壞。根據(jù)前面的標(biāo)志物(Apoe, Glul, Clu)，進(jìn)一步細(xì)分兩組繆勒氏細(xì)胞亞群，并命名為Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞和Ctxn3-繆勒氏細(xì)胞。利用免疫熒光驗證兩個亞群在組織的存在，但由于結(jié)果的模糊性，后續(xù)還需要進(jìn)一步進(jìn)行更多的實驗。通過前期的文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸（GABA）轉(zhuǎn)運蛋白，細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶，這些均消除谷氨酸積累，減少其引起的細(xì)胞毒性。而這兩組亞群中Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞呈現(xiàn)比較強的GABA轉(zhuǎn)運代謝的功能。Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞同時還特異性高表達(dá)血管粘附因子(vascular adhesion molecule, VCAM1)，還能釋放炎癥因子如：IL33。這些都表明Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞和視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)相關(guān)性更強。通過SCENIC分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分析Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞在疾病中的作用。結(jié)果顯示兩類轉(zhuǎn)錄因子在Ctxn3+繆勒氏細(xì)胞中主要上調(diào)；(1) AP-1家族成員，如：Jun、Fos和Jund；(2) SOX家族成員，如：Sox2和Sox9。UMAP圖顯示了重要轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因的表達(dá)情況。通過網(wǎng)絡(luò)圖，我們發(fā)現(xiàn)AP-1家族可以調(diào)節(jié)Id蛋白(DNA結(jié)合/分化抑制蛋白)的變化。

3. 內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的特性及其相互關(guān)系

血小板衍生生長因子受體β(Platelet-derived growth factor receptor beta, pdgfrβ)在血管壁細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮重要作用(包括周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞)。結(jié)果顯示pdgfrβ在cluster 20和cluster 27中高表達(dá)。因此，將這兩個細(xì)胞群進(jìn)一步定義為周細(xì)胞的亞群，分別命名為周細(xì)胞A亞群和周細(xì)胞B亞群。通過分析血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，發(fā)現(xiàn)了一系列有潛力的新靶點。KEGG分析顯示，周細(xì)胞A亞群和周細(xì)胞B亞群均表現(xiàn)血管平滑肌收縮功能增強，該功能與周細(xì)胞局部調(diào)節(jié)微血管血流的特征相關(guān)。隨后分析比較了兩組周細(xì)胞基因集變異分析(GSVA)，結(jié)果顯示周細(xì)胞A亞群具有增加的ECM受體相互作用和其他途徑，而周細(xì)胞B亞群富集血管平滑肌收縮和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等途徑。

4. 繆勒氏細(xì)胞和iBRB的通訊網(wǎng)絡(luò)

為了揭示早期DR中iBRB損傷的潛在機制，本文深入研究了繆勒氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的復(fù)雜通訊。使用CellChat分析，我們發(fā)現(xiàn)繆勒氏細(xì)胞通過分泌因子在iBRB的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著潛在作用。研究表明，Vegf/Vegfr2信號通路最有可能影響生物合成、分泌，也參與到繆勒氏細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)降解過程，從而促進(jìn)繆勒氏細(xì)胞的存活并具有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，兩組繆勒氏細(xì)胞均分泌胰島素樣生長因子2 (Igf2)，該因子作用于周細(xì)胞B亞群上的受體Igf2r，調(diào)節(jié)其增殖分化和存活。血管生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like protein 4, Angptl4)由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，不僅作用于繆勒氏細(xì)胞和周細(xì)胞，還影響自身。內(nèi)皮細(xì)胞通過Angptl4-Cdh11/Sdc4/Sdc2對繆勒氏細(xì)胞和周細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用，但其具體功能值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

Wang Y, Yang X, Li Q, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the Müller subtypes and inner blood-retinal barrier regulatory network in early diabetic retinopathy.?Front Mol Neurosci. 2022;15:1048634. Published 2022 Dec 1. doi:10.3389/fnmol.2022.1048634