前言

2022年02月，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院李敏教授課題組在Biomedicine & Pharmacotherapy發(fā)表的題為 “Yiqi Tongluo Fang could preventive and delayed development and formation of diabetic retinopathy through antioxidant and anti-inflammatory effects ”的研究成果，發(fā)現(xiàn)了益氣通絡(luò)方可有效地防治糖尿病并發(fā)癥形成與發(fā)展，探究了益氣通絡(luò)方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機制，益氣通絡(luò)方可改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織病理損害；提高視網(wǎng)膜緊密連接蛋白，保護血-視網(wǎng)膜屏障；抑制p38MAPK相關(guān)通路及IncRNA MALAT1水平；降低全身及局部視網(wǎng)膜的炎癥及氧化應(yīng)激水平。為益氣通絡(luò)方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了實驗依據(jù)。LC-MS+GC-MS雙平臺代謝組學(xué)主要用于全面的中藥成分分析。

中文標題：益氣通絡(luò)藥方通過抗炎和抗氧化作用預(yù)防及延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的機制研究

研究對象：大鼠

發(fā)表期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

影響因子：6.529

發(fā)表時間：2022年2月

合作單位：中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院

運用生物技術(shù)：LC-MS+GC-MS雙平臺代謝組學(xué)（由鹿明生物提供技術(shù)支持）

研究背景

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的患病率逐年增加。DR的發(fā)病機制復(fù)雜，主要包括炎癥和氧化應(yīng)激。而中藥處方益氣通絡(luò)方可有效防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的形成與發(fā)展，但其作用機制尚不清楚。本篇研究通過對益氣通絡(luò)方防治糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變相關(guān)機制深入研究，探尋益氣通絡(luò)方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的內(nèi)在途徑和機制。

研究思路

實驗方法

1. 實驗分組/研究材料

實驗分組

（1）正常對照組：25只

（2）糖尿病對照組：25只

（3）糖尿病+胰島素+羥苯磺酸鈣（CaD）組：25只

（4）糖尿病+胰島素+益氣通絡(luò)方（YQTLF）組：25只

研究材料

SD雄性大鼠；鏈脲佐菌素；羥苯磺酸鈣；益氣通絡(luò)方；復(fù)方托吡卡胺滴眼液；鹽酸奧布卡因滴眼液；熒光素鈉注射液；ELISA試劑盒；BCA分析試劑盒；多聚甲醛；蒸餾水；乙醇等

2.技術(shù)路線

2.1 LC-MS+GC-MS：測定YQTLF代謝物

2.2 生化檢驗：自動生化分析儀測量血清相關(guān)指標濃度；ELISA試劑盒測定血清氧化應(yīng)激和炎癥參數(shù)

2.3胰蛋白酶消化試驗：計數(shù)無細胞毛細血管、內(nèi)皮細胞和周細胞的數(shù)量、內(nèi)皮細胞與周細胞的比率

2.4 Tunnel法：顯微鏡下觀察凋亡細胞

2.5 Western blot：BCA分析試劑盒對大鼠視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的含量量化

2.6 RT-PCR：大鼠視網(wǎng)膜中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴增SYBR PCR混合物，采用2-△△ct法相對定量分析

研究結(jié)果

LC-MS鑒定YQTLF的代謝產(chǎn)物譜

UPLC-MS在YQTLF中共檢測到15105個物質(zhì)峰，其中鑒定出6058個代謝物，包括來自負離子模型的2365個代謝物和來自正離子模型的3693個代謝物（圖1）。

圖1| YQTLF水提取物的總離子色譜圖

GC-MS鑒定YQTLF的代謝產(chǎn)物譜

用GC-MS代謝組學(xué)在YQTLF中共識別出1024個有效峰，基于質(zhì)譜匹配確定了291種代謝物。

YQTLF治療對體重和糖脂的影響

代謝12周后，糖尿病組大鼠的體重顯著低于正常組。服用CaD或YQTLF的糖尿病大鼠的體重和血糖水平與糖尿病大鼠相似。與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清中的脂質(zhì)水平顯著增加。CaD和YQTLF顯著降低了由糖尿病引起的脂質(zhì)水平升高，且YQTLF組血脂水平低于接受CaD治療的糖尿病大鼠（圖2）。

圖2 | 不同組間的體重、空腹血糖和生化指標比較

YQTLF治療對視網(wǎng)膜組織學(xué)的影響

YQTLF對視網(wǎng)膜組織學(xué)的影響通過以下方法進行評估：包括FP、FFA、H&E染色、視網(wǎng)膜胰蛋白酶消化鋪片試驗和TUNEL染色。

圖3 | FP和FFA檢查圖

H&E染色測定每層的厚度，對照組大鼠的視網(wǎng)膜組織良好。但糖尿病大鼠各層細胞排列松散、不規(guī)則且結(jié)構(gòu)紊亂。CaD和YQTLF處理改善了每層受損細胞（圖4A）。與對照組相比，糖尿病大鼠的ONL、OPL、INL、IPL和GGL以及整個視網(wǎng)膜的ONL、OPL、INL、IPL和GGL顯著降低。與糖尿病大鼠相比，CaD和YQTLF增加了視網(wǎng)膜的厚度。結(jié)果表明，與CaD治療相比，YQTLF治療改善了視網(wǎng)膜組織厚度和整個視網(wǎng)膜（圖4B）。

圖4?| 不同組間視網(wǎng)膜每層厚度和損傷的變化及各層厚度的比較

視網(wǎng)膜胰蛋白酶消化試驗用于研究無細胞毛細血管和細胞，包括內(nèi)皮細胞和周細胞。與對照組相比，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細血管扭曲，無細胞毛細血管數(shù)量顯著增加。CaD和YQTLF治療顯著減少無細胞毛細血管數(shù)量。與對照組相比，糖尿病大鼠的內(nèi)皮細胞與周細胞的比率（E/P）顯著增加。結(jié)果表明，CaD和YQTLF治療均顯著降低E/P（圖5）。

圖5?| 不同組間視網(wǎng)膜胰蛋白酶消化圖及無細胞毛細血管數(shù)量和內(nèi)皮細胞與周細胞比率的比較

TUNEL染色檢測視網(wǎng)膜細胞凋亡。與對照組相比，糖尿病大鼠的TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增加。CaD和YQTLF治療顯著減少了凋亡細胞的數(shù)量（圖6）。

圖6?| 不同組間的視網(wǎng)膜細胞凋亡的變化及陽性細胞的比較

YQTLF治療12周后顯著提高視網(wǎng)膜緊密連接表達

與對照組相比，糖尿病導(dǎo)致ZO-1、occludin、claudin-5和VE鈣粘蛋白水平顯著降低。盡管ZO-1 mRNA沒有顯著差異，但CaD和YQTLF均增加了ZO-1、occludin、claudin-5、VE鈣粘蛋白和mRNA水平。CaD和YQTLF的ZO-1和claudin-5蛋白水平、CaD的ZO-1、ZO-1 mRNA、YQTLF的ZO1和claudin-5 mRNA水平?jīng)]有顯著差異（圖7）。

圖7?| 不同組間緊密連接蛋白和mRNA水平的比較

?YQTLF治療12周后顯著抑制視網(wǎng)膜PRC 2/p38 MAPK通路

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，糖尿病大鼠的EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR表達水平顯著升高。CaD和YQTLF治療的糖尿病大鼠，p38 MAPK相關(guān)通路蛋白水平均顯著降低。但YQTLF對PRC 2/p 38 MAPK通路抑制效果優(yōu)于CaD（圖8）。

圖8?| 不同組間PRC 2/p38 MAPK通路蛋白水平的比較

RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，糖尿病大鼠的PRC2、EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR表達顯著升高。CaD治療的糖尿病大鼠中，EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR的mRNA水平均降低。YQTLF治療的糖尿病大鼠中， EZH2、SUZ12、EED和p38 MAPK的mRNA水平降低，有顯著差異；PRC2、MMP-9和VEGFR的mRNA水平降低，但無顯著差異（圖9）。

圖9?| 不同組間PRC 2/p38 MAPK通路mRNA水平的比較

YQTLF治療12周后顯著抑制視網(wǎng)膜lncRNA MALAT1表達

糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜中，lncRNA MALAT1的表達與對照組相比顯著增加。CaD和YQTLF治療可抑制糖尿病誘導(dǎo)的lncRNA MALAT1上調(diào)（圖10）。

圖10?| 不同組間LncRNA MALAT1水平的比較

YQTLF治療對氧化應(yīng)激和炎癥的影響

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗和WB來評估CaD和YQTLF對血清和視網(wǎng)膜中氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響。與對照組相比，糖尿病大鼠血清中包括ROS、iNOS、NO和MDA的氧化應(yīng)激因子顯著升高，SOD和CAT顯著降低。CaD和YQTLF治療顯著阻止了這種變化。與對照組相比，糖尿病大鼠血清中包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的炎癥因子顯著增加，CaD和YQTLF的治療顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平。YQTLF治療組的炎癥因子水平低于CaD治療組。與對照組相比，糖尿病視網(wǎng)膜中的NF-kB p65和TNF-α蛋白水平均升高。CaD和YQTLF治療均可降低糖尿病誘導(dǎo)升高的NF-kB p65和TNF-α蛋白（圖11）。

圖11?| 不同組間氧化應(yīng)激和炎癥誘導(dǎo)物水平的比較

相關(guān)結(jié)論

本篇研究表明，益氣通絡(luò)方（TQTLF）能有效防治糖尿病視網(wǎng)膜病變，而且在保護和改善病理狀態(tài)方面起著至關(guān)鍵作用。糖尿病視網(wǎng)膜中的BRB分解與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)，YQTLF通過改善BRB的通透性，降低了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，因為TQTLF改善了糖尿病誘導(dǎo)的血清蛋白質(zhì)中NF-κB p65、ROS、iNOS、NO、MDA、SOD、CAT、TNF-α和IL-1β的變化。

小鹿推薦

文章通過對中藥處方—益氣通絡(luò)方改善糖尿病病理方面的深入研究，表明在預(yù)防及治療方面和微觀層面均起到了顯著效果。同時，也探究出益氣通絡(luò)方的內(nèi)在作用機制。也為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期治療，提供顯著、有效的治療方法。其中LC-MS+GC-MS雙平臺代謝組學(xué)有助于對中藥成分進行全面的分析，為藥物機制提供參考。

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參考文獻

[1] F. Lian, Q. Ni, Y. Shen, S. Yang, C. Piao, J. Wang, J. Wei, J. Duan, Z. Fang, H. Lu, G. Yang, L. Zhao, J. Song, Q. Li, Y. Zheng, Y. Lyu, X. Tong, International traditional Chinese medicine guideline for diagnostic and treatment principles of diabetes, Ann. Palliat. Med 9 (4) (2020) 2237–2250.

[2] T. Bulum, M. Tomi′c, L. Duvnjak, Total serum cholesterol increases risk for development and progression of nonproliferative retinopathy in patients with Type 1 diabetes without therapeutic intervention: prospective, observational study, Arch. Med Res 48 (5) (2017) 467–471.

[3] S. Srinivasan, C. Dehghani, N. Pritchard, K. Edwards, A.W. Russell, R.A. Malik, N. Efron, Opht-

halmic and clinical factors that predict four-year development and worsening of diabetic retin-

opathy in type 1 diabetes, J. Diabetes Complicat. 32 (1) (2018) 67–74.

[4] S.S. Hammer, J.V. Busik, The role of dyslipidemia in diabetic retinopathy, Vis. Res 139 (2017) 228–236.

[5] R.P. Singh, M.J. Elman, S.K. Singh, A.E. Fung, I. Stoilov, Advances in the treatment of diabetic

retinopathy, J. Diabetes Complicat. 33 (12) (2019), 107417.

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