細胞外囊泡（EVs）是細胞間通訊的重要載體，在尿液、血漿等體液中普遍存在。EVs包含蛋白、磷酸化蛋白等多種物質(zhì)，參與到腫瘤等疾病發(fā)生過程，因此，EVs的高效分離及分析在標志物篩選和疾病診斷方面具有巨大的潛力。目前，傳統(tǒng)EVs分離（如離心法、試劑盒法）各有缺陷，如耗時長、回收率差等，限制了其廣泛應(yīng)用，故需要一種快速、高效的細胞外囊泡分離方法。

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2021年1月，中科新生命技術(shù)專家顧問、美國普渡大學(xué)陶緯國教授研究團隊在ACS Appl Mater Interfaces（IF 8.758）雜志上發(fā)表題為“Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis”的研究成果，該研究基于新優(yōu)化的分離方法——功能化磁珠法，高效地從尿液中分離出細胞外囊泡，該方法具有低污染、高回收率（>80%）以及分離時間短（<1h）等優(yōu)點。同時，結(jié)合4D-蛋白質(zhì)組、4D-磷酸化蛋白質(zhì)組等新技術(shù)對前列腺癌患者和健康個體尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)，表明其在臨床研究中的巨大應(yīng)用潛力。

研究材料：10例前列腺癌患者和10例健康人的尿液樣本

技術(shù)方法：細胞外囊泡分離、4D-蛋白質(zhì)組、4D-磷酸化蛋白質(zhì)組

實驗路線圖：

步驟1：雙功能磁珠BiMBs制備和EVs表征

步驟2：不同EVs分離方法比較分析

步驟3：尿液細胞外囊泡全蛋白質(zhì)組分析

步驟4：前列腺癌尿液外囊泡磷酸化蛋白質(zhì)組分析

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研究結(jié)果：

1、 BiMBs制備和EVs表征分析

?研究人員開發(fā)出一種新型的EVs分離磁珠：雙功能磁珠BiMBs。為研究其分離效率，研究者對3種類型磁珠分離的EVs進行分析檢測：僅Ti(IV)固定的磁珠（TiMBs），僅用DSPE固定的磁珠（DspeMBs）以及同時用Ti(IV)和DSPE固定的功能磁珠（BiBMs）。

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通過透射電鏡、納米粒子跟蹤分析技術(shù)（NTA）和蛋白質(zhì)免疫印跡（WB） 等技術(shù)手段對分離的EVs的結(jié)構(gòu)、粒徑、EVs標志分子（CD9、CD63）進行分析。結(jié)果顯示，從BiBMs磁珠洗脫的EVs具有完整膜結(jié)構(gòu)，平均粒徑為125.7nm，且膜結(jié)構(gòu)上表達CD9、CD63蛋白。

2、不同細胞外囊泡分離方法效率評估

?為了與傳統(tǒng)EVs分離方法（超速離心法、UC）進行比較，研究人員通過WB檢測EVs的標志分子CD9表達強度。結(jié)果顯示，BiMBs方法表現(xiàn)出最高的分離效率，CD9表達強度分別為：BiMBs (81%) > TiMBs (69%) > DspeMBs(61%) > UC (30%)。TiMBs和DspeMBs都是基于化學(xué)親和原理捕獲EVs，相較UC方法具有更高的分離效率，而BiMBs可進一步提高分離效率，可能是由于兩個官能團的協(xié)同作用。

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?3、EVs全蛋白質(zhì)組比較分析

?研究人員進一步應(yīng)用4D-蛋白質(zhì)組技術(shù)對不同分離方法獲得的尿液EVs的全蛋白表達進行分析，BiBMs分離的EVs鑒定到36262條特有肽段，對應(yīng)3302種特有蛋白。為所有方法中鑒定量最高。將BiBMs分離鑒定到的蛋白質(zhì)與ExoCarta上發(fā)表的前100種外泌體標志蛋白質(zhì)進行比較發(fā)現(xiàn)，有95種蛋白重疊，為4種方法中與數(shù)據(jù)庫重疊度最高。為進一步評估4種方法分離EVs的選擇性，通過無標記定量方法對13種外泌體標志蛋白和3種尿液特異標志物進行定量分析，基于磁珠分離方法均表現(xiàn)出更高的信號強度，顯著優(yōu)于UC方法。

4、前列腺癌尿液EVs磷酸化蛋白質(zhì)組分析

?隨后，研究人員應(yīng)用BiBMs分離前列腺癌患者和健康對照尿液樣本的EVs，并通過4D-磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)分別從前列腺癌組和健康對照組中鑒定到6823條和6726條磷酸化肽段，分別匹配1564種和1413種磷酸化蛋白質(zhì)。相比健康對照組，在前列腺癌組中有121種磷酸化蛋白上調(diào)表達，103種下調(diào)表達。GO分析表明，這些上調(diào)表達的磷酸化蛋白參與的生物學(xué)過程包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化；分子功能則與蛋白激酶活性有關(guān)。KEGG通路分析表明，這些磷酸化蛋白主要參與例如PI3K-Akt/AMPK信號通路、前列腺癌通路等。

本研究開發(fā)出一種高效且特異性好的功能化磁性納米材料（BiMBs）應(yīng)用于EVs分離，通過對EVs的捕獲效率、純度、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的評估分析表明BiBMs的高效性及特異性。這種EVs分離策略結(jié)合4D組學(xué)技術(shù)，為無創(chuàng)生物標志物篩選提供強有力的工具，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。