基于新一代timsTOF Pro質(zhì)譜儀的4D-蛋白組學(xué)，使臨床轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)入全新4D時代。捕集離子淌度技術(shù)（TIMS）和平行積累連續(xù)碎裂（PASEF）方法的引入，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)組、修飾組學(xué)在覆蓋深度、靈敏度、穩(wěn)定性方面的全面提升。在臨床大隊(duì)列樣本分析方面，4D-DIA更是展現(xiàn)出的卓越穩(wěn)定性?？傊?，基于4D質(zhì)譜平臺開發(fā)的高通量和高靈敏度臨床蛋白組學(xué)方法，必將加速蛋白質(zhì)組學(xué)向臨床診斷中轉(zhuǎn)化，在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景。

COVID-19的爆發(fā)已成為全球性的大流行病，然而目前尚不清楚這種傳染病的發(fā)病機(jī)制以及與其他肺炎驅(qū)動因素的區(qū)別。本期為大家?guī)淼难芯砍晒且黄?D高通量蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)在新冠病毒方面的研究。

2020年11月17日，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心主任黃超蘭教授，中國科學(xué)院高福院士，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心陳揚(yáng)副研究員，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰教授共同通訊在Nature子刊Nature Communications(IF 12.121)在線發(fā)表題為《Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease》的研究論文，研究人員使用4D-DIA定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析了來自COVID-19感染病例、健康供體和非COVID-19肺炎病例的尿液樣本，分子變化表明免疫抑制和緊密連接（TJ）受損發(fā)生在COVID-19感染的早期。

將COVID-19患者進(jìn)一步細(xì)分為中度和重度類型后的研究顯示，在感染后期的重癥患者中也發(fā)現(xiàn)了某種程度激活的免疫應(yīng)答。對于COVID-19這種不尋常的病毒感染發(fā)病機(jī)制，課題組提出“兩階段”的機(jī)理，提高了我們對COVID-19感染的臨床特征的了解，并為將來的機(jī)理探索和治療研究提供了資源。

研究材料：

37例尿液樣本：健康對照（10例）；COVID-19患者（14例）；非COVID-19肺炎患者（13例）

技術(shù)方法：

DIA-PASEF蛋白組學(xué)（4D-DIA）

實(shí)驗(yàn)方法簡介：

步驟1：COVID-19疾病的尿蛋白質(zhì)組分析；

步驟2：在COVID-19疾病的早期階段，免疫系統(tǒng)受到抑制；

步驟3：嚴(yán)重COVID-19患者的免疫反應(yīng)被激活；

步驟4：討論COVID-19發(fā)病機(jī)理的“兩階段”模型。

研究結(jié)果

1、COVID-19疾病的尿蛋白質(zhì)組分析

利用4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在所有37個樣品中總共鑒定出5991個蛋白質(zhì)。與健康捐獻(xiàn)者和非COVID-19肺炎對照相比，COVID-19組的1986種蛋白質(zhì)水平發(fā)生了顯著變化，其中下調(diào)的蛋白質(zhì)比上調(diào)的蛋白質(zhì)多十倍。KEGG富集分析揭示了與COVID-19感染相關(guān)的分子全景，發(fā)現(xiàn)十多個途徑發(fā)生了顯著變化，尤其是免疫相關(guān)途徑、TJ途徑和代謝途徑等。

2、在COVID-19疾病的早期階段，免疫系統(tǒng)受到抑制

研究人員發(fā)現(xiàn)大量與免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白下調(diào)，表明在COVID-19患者中免疫應(yīng)答被抑制。在COVID-19患者中，蛋白酪氨酸磷酸酶受體C、瘦素和抗酒石酸酸性磷酸酶5的蛋白水平顯著下降。這些結(jié)果與COVID-19患者血液檢查中較低的淋巴細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)一致。補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q亞基C、補(bǔ)體C1r亞基和PZP樣含α-2-巨球蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白8下調(diào)，表明補(bǔ)體系統(tǒng)明顯受損。FcγR介導(dǎo)的吞噬作用涉及的脾酪氨酸蛋白激酶水平顯著降低，表明微噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用受到抑制。

研究者還觀察到COVID-19患者中載脂蛋白A-IV（APOA4）和載脂蛋白E下調(diào)，這可能與巨噬細(xì)胞功能有關(guān)。此外，研究人員觀察到趨化因子信號通路相關(guān)蛋白水平降低。

急性缺氧和ARDS是COVID-19患者高病死率的兩個主要原因。肺泡上皮屏障通透性的顯著增加是導(dǎo)致ARDS14低氧血癥的主要因素之一。肺上皮的屏障功能取決于一組TJ異聚復(fù)合物，這些復(fù)合物可密封相鄰上皮細(xì)胞之間的界面。在COVID-19患者中，許多涉及TJ形成和細(xì)胞-細(xì)胞粘附連接的蛋白質(zhì)被下調(diào)，表明該病毒可能會在入侵過程中改變細(xì)胞間TJ的形成和上皮形態(tài)發(fā)生，進(jìn)而破壞保護(hù)下面組織的物理屏障。

在COVID-19患者尿液中顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)中，金屬硫蛋白-1G、脂蛋白脂肪酶、β2M、PRKACA、FOLR2和APOA4與健康對照組和非COVID-19肺炎病例相比均有顯著變化。這些蛋白是用于COVID-19鑒別診斷以使其更精確的潛在生物標(biāo)志物。值得注意的是，六種蛋白質(zhì)中有四種與免疫應(yīng)答和TJ相關(guān)。

3、嚴(yán)重COVID-19患者的免疫反應(yīng)被激活

據(jù)報道，細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生在COVID-19患者的晚期，要了解COVID-19的發(fā)病機(jī)理，必須找出在疾病發(fā)展過程中發(fā)生了怎樣的過渡。研究人員將COVID-19患者分為9例中度病例和5例重癥病例。PCA顯示中度和重度COVID-19患者存在良好的分離。GO富集分析表明，大多數(shù)上調(diào)蛋白都參與補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和血小板活化等過程。

詳細(xì)研究中度和重度亞組，發(fā)現(xiàn)在疾病的晚期，免疫應(yīng)答被激活，這與嚴(yán)重和關(guān)鍵時期的COVID19患者中過度的免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子風(fēng)暴相一致。研究還確定了兩種特征蛋白，即免疫球蛋白λ變量3-25（immunoglobulin lambda variable 3–25）和延伸因子1-alpha 1（elongation factor 1-alpha 1），它們可能表征了COVID-19疾病兩個階段的進(jìn)展。

研究結(jié)果

多項(xiàng)研究表明，尿液樣本中檢測到的蛋白質(zhì)成分可以真正反映出人體健康狀況的變化。大部分尿蛋白來自穿過腎小球?yàn)V過屏障的血漿成分，以及來自腎臟和泌尿道的游離蛋白。因此，在不存在主泌尿疾病時，尿液的蛋白組成指示了一般健康狀況。

本研究利用4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)的變化，揭示了感染初期免疫抑制和COVID-19患者緊密連接受損的情況。在感染后期也檢測到一定程度的免疫激活。這些結(jié)果將為理解患者的臨床癥狀提供重要的分子基礎(chǔ)，并將闡明感染的兩個階段如何發(fā)生。在人類感染過程中，COVID-19的這些異常特征將指導(dǎo)人們進(jìn)一步了解COVID-19的發(fā)病機(jī)理，助力機(jī)理研究和臨床治療。

中科新生命DIA蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)品介紹

DIA技術(shù)由于其無偏見全覆蓋的掃描模式，具有傳統(tǒng)組學(xué)技術(shù)無法超越的定量穩(wěn)定性以及重復(fù)性等特點(diǎn)，在CNS期刊中的應(yīng)用越來越火熱。中科新生命自提供DIA技術(shù)服務(wù)以來，不僅在常規(guī)樣本的大隊(duì)列樣本檢測阿方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，也可提供一站式的標(biāo)志物研究DIA+PRM+機(jī)器學(xué)習(xí)服務(wù) ，基于腫瘤的蛋白基因組分型研究以及基于新一代色譜Evosep+4D-DIA的臨床大樣本蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。