BETd-260 (ZBC 260) 是由Cereblon配體和BET配體相連的PROTAC，在白血病細(xì)胞 RS4;11 中，在 30 pM 的低濃度下，能夠降低 BRD4 蛋白活性。BETd-260 能顯著抑制肝細(xì)胞癌 HCC 細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(apoptosis)。

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　　生物活性

　　體外研究

　　betd - 260 (ZBC260;化合物23)能夠在30-100 pM時(shí)誘導(dǎo)RS4白血病細(xì)胞中BRD2、BRD3和BRD4蛋白的降解。BETd-260對(duì)RS4;11白血病細(xì)胞和MOLM-13細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，ic50分別為51 pM和2.2 nM，并在3-10 nM誘導(dǎo)RS4;11和MOLM-13細(xì)胞系凋亡。

　　BETd-260在HCC細(xì)胞中相互調(diào)節(jié)幾種凋亡基因的表達(dá)，即抑制抗凋亡的Mcl-1、Bcl-2、c-Myc和XIAP的表達(dá)，而增加促凋亡的Bad的表達(dá)。

　　體內(nèi)研究

　　BETd-260 (5 mg/kg，靜脈注射，每隔一天一次，每周三次，連續(xù)3周)可使攜帶RS4;11種異種移植腫瘤的小鼠腫瘤快速消退，最大消退率>90%，小鼠無體重減輕或其他毒性跡象。BETd-260 (5 mg/kg，靜脈注射)降解BRD2、BRD3和BRD4蛋白超過24小時(shí)，在RS4;11異種移植小鼠模型中具有PARP和caspase-3的強(qiáng)裂解作用，并強(qiáng)烈下調(diào)c-Myc蛋白。

　　實(shí)驗(yàn)參考方法

　　細(xì)胞試驗(yàn)

　　在細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為10000 ~ 20000個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)液為100 μL。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中連續(xù)稀釋BETd-260，將含有BETd-260的稀釋溶液100 μL加入到細(xì)胞板的適當(dāng)孔中。加入BETd-260后，細(xì)胞在5% CO2的環(huán)境中，37°C孵育4天。細(xì)胞生長(zhǎng)通過乳酸脫氫酶為基礎(chǔ)的WST-8測(cè)定，使用多模式微孔板閱讀器進(jìn)行評(píng)估。將WST-8試劑加到板上，孵育至少1小時(shí)，在450 nm處讀取。將讀數(shù)歸一化到dmso處理后的細(xì)胞，使用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行非線性回歸分析計(jì)算IC50。

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

　　小鼠

　　將5 × 106 RS4;11細(xì)胞(含50% Matrigel)皮下注射于重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠背側(cè)，每只小鼠1個(gè)腫瘤，形成異種移植腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到約100 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為BETd-260治療組和對(duì)照組。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物是否有任何毒性跡象，在治療期間每周稱重2-3次，在BETd-260治療結(jié)束后至少每周稱重一次。在治療期間，每周用電子卡尺測(cè)量腫瘤大小2-3次，治療結(jié)束后至少每周測(cè)量一次。腫瘤體積計(jì)算公式為V = LW2/2，其中L為腫瘤的長(zhǎng)度，W為腫瘤的寬度。

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。