結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第三位和第二位[1]。盡管目前診斷和治療能力有了顯著的提升，但大多數(shù)結(jié)直腸癌患者都是在晚期被診斷出來的，而這時已經(jīng)錯失了最佳治療時機(jī)；雖然近年來，免疫治療給一定數(shù)量的癌癥患者帶來了希望，但是大量患者對免疫治療并不敏感。因此迫切需要新的治療方法來提高免疫治療在結(jié)直腸癌治療中的效果。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種非編碼RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)circRNAs通過miRNA海綿、RNA結(jié)合蛋白支架和微蛋白等多種機(jī)制在癌細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，circRNAs還是癌癥診斷、治療和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。在結(jié)直腸癌中已發(fā)現(xiàn)和研究了大量異常的circRNAs。但這些circRNA大多是致癌的，而具有腫瘤抑制作用的circRNAs卻很少有報道。并且，這些circRNA如何發(fā)揮抗腫瘤作用在很大程度上仍不清楚[2]。

2023年6月1日，廈門大學(xué)藥學(xué)院劉文教授課題組與廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院葉峰教授課題組在Clinical?Cancer?Research（IF=13.801）雜志上發(fā)表A Tumor-suppressive Molecular Axis EP300/circRERE/miR-6837-3p/MAVS Activates Type I IFN Pathway and Antitumor Immunity to Suppress Colorectal Cancer的文章。在這篇文章中，作者揭示了EP300/circRERE/miR-6837-3p/MAVS的調(diào)節(jié)軸及其在抗腫瘤免疫中的重要作用。

1.circRNA研究

1.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測，獲得目的circRNA

作者對結(jié)直腸癌及癌旁正常組織進(jìn)行circRNA測序，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，分別有38個和48個circRNA表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。在此研究中，作者重點(diǎn)研究是下調(diào)的circRNAs。此外，在下調(diào)后續(xù)circRNA中基于TCGA數(shù)據(jù)庫確定了兩個基因，Rere和PARM1。然后作者設(shè)計了針對circRERE和circPARM1的siRNA，發(fā)現(xiàn)circRERE是HCT116細(xì)胞生長所必需的，而不是circPARM1，因此用于進(jìn)一步研究。

1.2circRNA表達(dá)研究

作者檢測了75對結(jié)直腸癌及其周圍正常組織的RERE和circRERE表達(dá)。此外還檢測了circRERE在五個不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，HCT116與RKO細(xì)胞系中表達(dá)本地最高。

1.3circRNA表型研究

用DLD1和LoVo細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，用HCT116和RKO細(xì)胞進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)。circRERE的過表達(dá)抑制了DLD1和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞增殖和克隆形成。相反，circRERE的敲除促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和在HCT116和RKO細(xì)胞中的克隆形成。綜上所述，circRERE在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并在結(jié)直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。

1.4環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)特征

circRERE由RERE基因的3個外顯子組成，全長469個核苷酸。從HCT116細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RNase R外切酶消化和放線菌素D處理，驗(yàn)證circRERE的穩(wěn)定性。FISH結(jié)果表明，circRERE主要定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.circRNA調(diào)控機(jī)制

2.1確定MAVS靶基因

與其他研究者不同，作者首先確定circRERE調(diào)控的IFNα靶通路，作者對HCT116和RKO敲低細(xì)胞進(jìn)行測序分析，認(rèn)為circRERE正向調(diào)節(jié)IFNA通路。IFNa通路主要受cGAS/STING和RIG-I/MAVS信號通路的調(diào)控。為了研究circRERE如何影響這一途徑的分子機(jī)制，檢測了circRERE對轉(zhuǎn)染si nc或si circRERE的HCT116細(xì)胞中RIG-I、MAVS這兩個關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)的影響。最后認(rèn)為MAVS是circRERE激活的IFNα和ISG所必需的。

2.2miRNA海綿機(jī)制

分析circRERE是如何調(diào)控MAVS的，作者認(rèn)為可能存在海綿機(jī)制，使用算法來預(yù)測可以與circRERE和MAVS結(jié)合的miRNAs。MIR-6837-3P被預(yù)測為同時針對RERE和MAVS的miRNA。為了檢測miR-6837-3p是否能與circRERE結(jié)合，用生物素標(biāo)記的對照探針或circRERE探針進(jìn)行ChIRP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circRERE探針對MIR-6837-3P有顯著的富集作用。同時進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-6837-3P與circRERE的結(jié)合，miR-6837-3P與MAVS結(jié)合。綜上所述，circRERE通過海綿miR-6837-3p穩(wěn)定MAVS的表達(dá)，激活I(lǐng)型干擾素信號通路，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長。

3.circRNA生成機(jī)制

circRERE在結(jié)直腸癌中的腫瘤抑制作用促使作者進(jìn)一步研究其生成機(jī)制。通過PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測了與Rere啟動子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)現(xiàn)有40個轉(zhuǎn)錄因子具有這種潛力。經(jīng)過篩選后，表明EP300與Rere的相關(guān)性最強(qiáng)。為了確定EP300是否調(diào)節(jié)circRERE生成，進(jìn)行了qRT-PCR分析，芯片分析，熒光素酶實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明EP300通過與Rere啟動子結(jié)合來調(diào)控circRERE的表達(dá)。接下來，測試了EP300是否影響MAVS的表達(dá)。EP300的過表達(dá)導(dǎo)致MAVS在mRNA和蛋白水平上的顯著增加，當(dāng)circRERE被下調(diào)時，這一作用在很大程度上被取消，表明EP300通過circRERE調(diào)節(jié)MAVS的表達(dá)。綜上所述，EP300在調(diào)控circRERE和MAVS在結(jié)直腸癌中的表達(dá)方面起著正向調(diào)控的作用。

4.circRNA動物實(shí)驗(yàn)

circRERE的腫瘤抑制作用促使作者探索circRERE是否可以作為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。為此，作者將小鼠皮下接種HCT116細(xì)胞，然后隨機(jī)分成兩組，分別給予NC-AAV和circRERE-AAV治療，每周一次。與NC-AAV相比，circRERE-AAV治療的腫瘤明顯減少。為了將circRERE調(diào)控的靶基因與其在腫瘤生長中的功能聯(lián)系起來，circRERE-AAV治療的腫瘤表達(dá)了顯著更高水平的circRERE、MAVS、IFNA1和ISGs。MAVS介導(dǎo)的I型干擾素信號通路被認(rèn)為通過募集T細(xì)胞等免疫細(xì)胞來增強(qiáng)抗腫瘤免疫。因此，circRERE-AAV有可能提高抗PD-1抗體等ICIS的效果。

綜上所述，circRERE-AAV具有較強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用，并能提高抗PD-1抗體對結(jié)直腸癌的治療效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2021;71:209–49.

[2]Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, Bramsen JB, Finsen B, Damgaard CK, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 2013;495:384–8.

原文鏈接：

https://aacrjournals.org/clincancerres/article/29/11/2095/726414/A-Tumor-suppressive-Molecular-Axis-EP300-circRERE