非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型，約占所有肺癌的80%，其具有高發(fā)病率和死亡率。若早期發(fā)現(xiàn)并治療可將死亡率降低10至50倍。開發(fā)新的微創(chuàng)且可靠的方法如循環(huán)生物標(biāo)志物，用于NSCLC的早期檢測(cè)，對(duì)于該疾病的臨床判定或者及早的治療至關(guān)重要。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體能夠從細(xì)胞內(nèi)捕獲重要信息，其蛋白與直接在血液中檢測(cè)到的蛋白相比具有更高的敏感性，并且比分泌蛋白具有更高特異性，被視為腫瘤診斷和預(yù)后的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物。

那么，攜帶重要生物信息的外泌體在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用又是怎樣的呢？咱們通過(guò)兩篇文獻(xiàn)來(lái)探討一下。

01?外泌體誘導(dǎo)的活化成纖維細(xì)胞分泌組作為非小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志物

期刊名稱：Small

影響因子：15.153

樣本策略：用來(lái)自A549細(xì)胞的外泌體處理MRC5細(xì)胞72h之后，棄去培養(yǎng)基并進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)中的分泌蛋白

技術(shù)策略：外泌體獲得并表征、qPCR、蛋白組學(xué)

文獻(xiàn)背景

成纖維細(xì)胞（NFs）是基質(zhì)細(xì)胞的主要成分，也是膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)蛋白的主要來(lái)源。成纖維細(xì)胞在被腫瘤衍生因子激活后可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞/癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）。將NFs轉(zhuǎn)化為CAFs是多種實(shí)體腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。

思路導(dǎo)圖

結(jié)果速遞

1：外泌體激活成纖維細(xì)胞

對(duì)不同時(shí)間收集的A549細(xì)胞外泌體進(jìn)行表征，并用這些外泌體與成纖維細(xì)胞（MRC5）共培養(yǎng)。用qPCR方法檢測(cè)CAFs標(biāo)志物α-SMA、VIM、FSP1、PDGFRβ的基因表達(dá)水平（圖1?A,B）；MRC5細(xì)胞與外泌體孵育后72 h，形態(tài)呈現(xiàn)典型的紡錘形，具有平面極性，并向同一方向排列，證實(shí)了腫瘤來(lái)源的外泌體激活了NFs（圖1?C）；用蛋白組學(xué)LFQ方法檢測(cè)經(jīng)外泌體處理的MRC5、未經(jīng)外泌體處理的MRC5之間的蛋白成分，在600多個(gè)蛋白中發(fā)現(xiàn)約有130個(gè)與ECM相關(guān)的蛋白。

2：外泌體激活的成纖維細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)參與了ECM的重塑

蛋白組學(xué)結(jié)果表明，在302種差異蛋白中有77種蛋白參與ECM重塑（圖2A）。通常存在于骨髓中的層粘連蛋白家族蛋白（LAMA4、LAMA5、LAMB1和LAMB2）在外泌體處理的MRC5細(xì)胞的分泌蛋白中上調(diào)；外泌體處理的MRC5細(xì)胞中顯著變化的蛋白更多屬于是“ECM糖蛋白”和“ECM調(diào)節(jié)因子”，如PLOD家族、LOX家族、PLAT和TNC，占約60%（46/77）的注釋的Matrisome蛋白（圖2C，D）。富含Matri某些蛋白的途徑與腫瘤和腫瘤微環(huán)境有關(guān)，如“ECM受體相互作用”和“病灶粘附”（圖2E）。整體來(lái)講，外泌體處理的成纖維細(xì)胞改變了蛋白質(zhì)分泌，導(dǎo)致ECM重組，并為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了有利的微環(huán)境。

3：編碼外泌體調(diào)節(jié)分泌蛋白的基因作為NSCLC診斷標(biāo)志物

基于1897例非小細(xì)胞肺癌或其他肺部疾病患者的差異分泌蛋白和多個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集，確定了一種能有效區(qū)分腫瘤組織與正常組織、腫瘤相關(guān)間質(zhì)與正常間質(zhì)的診斷標(biāo)志物：用A549衍生外泌體處理的MRC5細(xì)胞分泌的FHL1蛋白的豐度顯著低于未處理的MRC5細(xì)胞，這與GSE22863中FHL1在腫瘤基質(zhì)中下調(diào)而在正常肺組織中不下調(diào)的事實(shí)相一致，乳腺癌和肝癌，癌變通常伴隨著FHL1的降低。為了進(jìn)一步研究FHL1診斷其他肺部疾病的能力，文章計(jì)算并對(duì)比了包括慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、系統(tǒng)性硬化相關(guān)間質(zhì)性肺病和特發(fā)性間質(zhì)性肺炎在內(nèi)的AUC，計(jì)算范圍僅為0.50~0.85，這一結(jié)果指示FHL1是NSCLC相關(guān)間質(zhì)或腫瘤組織的特異性標(biāo)記物。

小結(jié)：

文章利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)確定正常成纖維細(xì)胞和外泌體激活的成纖維細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的豐度，首先鑒定出受肺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體影響的差異分泌蛋白，這些被注釋為非基質(zhì)體蛋白主要參與了碳水化合物的合成和降解，這是腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要過(guò)程；此外，基于由外泌體誘導(dǎo)的差異分泌蛋白相關(guān)的基因，確定了一種能有效區(qū)分腫瘤組織與正常組織、腫瘤相關(guān)間質(zhì)與正常間質(zhì)的診斷標(biāo)志物，這可能有助于制定個(gè)性化的臨床治療策略。

02?腫瘤衍生外泌體蛋白作為非小細(xì)胞肺癌的診斷生物標(biāo)志物

期刊名稱：Cancer Sci.

影響因子：6.518

樣本選擇：健康供體（n=46）和NSCLC患者（n=125）中分離血清外泌體

技術(shù)策略：蛋白組學(xué)、elisa

文獻(xiàn)背景

AHSG（α-2-HS-糖蛋白，也稱為胎球蛋白-A）是主要的血清蛋白成分，可發(fā)揮多種鈣依賴性生理活性，并可介導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)；ECM1蛋白是胞外基質(zhì)的重要組成成分，能夠促進(jìn)大多數(shù)癌癥的進(jìn)展和侵襲，并被鑒定為轉(zhuǎn)移增加和預(yù)后不良的指標(biāo)。因此，從NSCLC患者和健康個(gè)體的血清中分離的外泌體中檢測(cè)其表達(dá)水平，促使進(jìn)一步探索外泌體AHSG和ECM1在癌癥診斷中的價(jià)值。

結(jié)果呈現(xiàn)

通過(guò)超速離心從健康供體（n=46）和NSCLC患者（n=125）中分離血清外泌體，并使用透射電子顯微鏡、qNano和WB進(jìn)行表征。蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜顯示C出健康組和NSCLC組中多種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。

與健康組相比，NSCLC患者的α-2-HS-糖蛋白（AHSG）和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（ECM1）的外體表達(dá)水平顯著增加。AHSG在NSCLC與健康個(gè)體的曲線（AUC）分別為0.736和0.682；ECM1也顯示出對(duì)癌癥和早期NSCLC的診斷能力，AUC值分別為0.683和0.656。結(jié)合這兩種標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)NSCLC和早期患者的AUC提高到0.795和0.739。

文章又將AHSG與CEA（一種在NSCLC診斷過(guò)程中常用的非特異性血清腫瘤生物標(biāo)記物）聯(lián)合用于NSCLC的診斷，與健康個(gè)體相比，NSCLC的診斷值A(chǔ)UC為0.938，早期NSCLC為0.911。結(jié)果表明，在NSCLC患者的血清e(cuò)xosomes中發(fā)現(xiàn)的新蛋白質(zhì)組特征顯示出作為診斷工具的潛在有用性。

(A/B：AHSG和CEA聯(lián)合診斷NSCLC。NSCLC患者與健康供體（A）和早期NSCLC患者和健康供體（B）。C/D：ECM1和CEA聯(lián)合診斷NSCLC。NSCLC患者和健康供體（C）、早期NSCLC患者與健康供體（D）。E/?F：AHSG、ECM1和CEA聯(lián)合診斷NSCLC。NSCLC患者與健康供體（E）和早期NSCLC患者和健康供體（F））

小結(jié)：

文章通過(guò)微陣列鑒定的具有不同惡性程度的NSCLC外泌體中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)評(píng)估，表明血清外泌體含有對(duì)NSCLC具有潛在診斷和預(yù)后價(jià)值的特異性蛋白質(zhì)，其可作為癌癥生物標(biāo)志物。