新型冠狀病毒（SARS-CoV-2，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2）的人類傳播是新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）大流行的致病性病原體，給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)都帶來(lái)了巨大危機(jī)。目前研究發(fā)現(xiàn)該病毒會(huì)感染肺泡上皮2型細(xì)胞（AT2s），引起肺損傷和氣體交換受損，但其感染和病理機(jī)制尚不清楚。

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2020年12月17日，來(lái)自美國(guó)波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在CELL子刊Molecular Cell（IF 15.584）雜志上發(fā)表題目為"Actionable Cytopathogenic Host Responses of Human Alveolar Type 2 Cells to SARS-CoV-2"的研究成果，研究人員對(duì)感染SARS-CoV-2的iAT2s（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的AT2s）進(jìn)行了深入的定量時(shí)間磷酸化/蛋白質(zhì)組分析，以定量分析在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、3、6、24 hpi）由iAT2s中SARS-CoV-2感染引起的細(xì)胞病理學(xué)變化，揭示宿主細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，進(jìn)一步將該工作與永生細(xì)胞系的先前研究進(jìn)行了比較，系統(tǒng)級(jí)的預(yù)測(cè)病毒對(duì)肺細(xì)胞的影響以及哪些藥物可以減慢感染速度。?

研究材料：

感染（實(shí)驗(yàn)組）和未感染（對(duì)照組）SARS-CoV-2的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的肺泡上皮2型細(xì)胞（iAT2）；4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1、3、6、24 hpi。

技術(shù)方法：

TMT蛋白組學(xué)和TMT磷酸化蛋白組學(xué)

實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)介：

步驟1：構(gòu)建模型：肺部感染的病理生理模型；

步驟2：病毒感染iAT2s的定量時(shí)間質(zhì)譜分析（蛋白組+磷酸化蛋白組）；

步驟3：宿主蛋白質(zhì)組受到病毒感染的影響；

步驟4：分子支架解釋肺細(xì)胞反應(yīng)；

步驟5：磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)揭示失調(diào)的途徑；

步驟6：與SARS-CoV-2感染相關(guān)的功能網(wǎng)絡(luò)；

步驟7：抗病毒藥靶預(yù)測(cè)及驗(yàn)證；

步驟8：病毒感染后的分子反應(yīng)圖譜。

研究結(jié)果

?1、構(gòu)建模型：肺部感染的病理生理模型

通過(guò)定向分化從人多能干細(xì)胞（iPSC）系SPC2-ST-B2生成了iAT2，然后對(duì)表達(dá)tdTomato熒光報(bào)告基因的細(xì)胞進(jìn)行分選，分離出純度>95％的AT2樣細(xì)胞。iAT2最初以3D肺泡球培養(yǎng)，然后播種在Transwell插入片段上產(chǎn)生ALI（空氣-液體界面）培養(yǎng)物，以允許細(xì)胞從頂端表面感染。為了闡明受SARS-CoV-2影響的宿主系統(tǒng)，研究人員用新冠肺炎病毒感染iAT2 ALI培養(yǎng)物。免疫熒光分析（IFA）證實(shí)，感染后24 hpi的感染率約為20％。

2、病毒感染iAT2s的定量時(shí)間質(zhì)譜分析

利用TMT定量蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組對(duì)感染后的iAT2s （4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1、3、6、24 hpi）進(jìn)行檢測(cè)分析，總共定量了8,471種蛋白質(zhì)（包括8種病毒蛋白）和14,289個(gè)磷酸位點(diǎn)（位于2個(gè)病毒蛋白和2,703個(gè)宿主的磷酸化蛋白上），檢測(cè)到2,872個(gè)顯著蛋白（|log2 FC|>0.25，F(xiàn)DR<0.05），包括對(duì)表面活性劑功能至關(guān)重要的AT2標(biāo)記，如SFTPA2。同時(shí)， 4,688個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生改變（|log2 FC|>0.25，F(xiàn)DR<0.05），它們定位在1,166種獨(dú)特的肺部蛋白上（許多與肺細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑相對(duì)應(yīng)，包括蛋白激酶、磷酸酶、銜接子和轉(zhuǎn)錄因子）。

3、宿主蛋白質(zhì)組受到病毒感染的影響

為了表征初始iAT2宿主對(duì)感染的反應(yīng)，研究人員對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)（1-6 hpi）差異蛋白進(jìn)行監(jiān)督聚類發(fā)現(xiàn)了四個(gè)不同的Cluster，分別對(duì)應(yīng)于接種（~1 hpi）、早期（~3 hpi）和中/晚期（3-6 hpi）宿主蛋白表達(dá)波動(dòng)。Cluster 1與病毒進(jìn)入（峰值~1 hpi）的快速反應(yīng)相關(guān)，富含先前與病毒感染和免疫相關(guān)的因子，包括TRAF6介導(dǎo)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)、NF-kB活化和C型凝集素受體的標(biāo)記物。Cluster 2-4 （3–6 hpi） 富含與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括檢查點(diǎn)激酶調(diào)節(jié)劑ATR和細(xì)胞死亡效應(yīng)因子CASP7/8的失調(diào)和有絲分裂檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑BUB1B，提示細(xì)胞周期停滯。

?與該觀察結(jié)果一致，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)揭示出SARS-CoV-2感染的iAT2s中PCNA表達(dá)明顯降低，表明病毒誘導(dǎo)的間期阻滯。從感染的時(shí)間過(guò)程中出現(xiàn)了連貫的模式，反映出明顯的功能富集。在24 hpi，檢測(cè)到八個(gè)不同的病毒蛋白（S、M、N、Orf3a/7a/8/9b，以及映射到多蛋白R(shí)ep1a的多個(gè)成分）。在感染SARS-CoV-2的Caco-2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相同的病毒蛋白，表明Rep1a的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)豐富，并通過(guò)蛋白水解產(chǎn)生優(yōu)先蛋白。

4、分子支架解釋肺細(xì)胞反應(yīng)

SARS-CoV-2編碼與宿主因子相互作用的蛋白酶、聚合酶和其他效應(yīng)子。為了表征感染期間可能在iAT2中發(fā)生哪些的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用（PPI），研究人員將蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)程數(shù)據(jù)疊加到了最近報(bào)道的SARS-CoV-2分子關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)上，以此推斷這些關(guān)聯(lián)的動(dòng)力學(xué)。在感染的iAT2中觀察到了許多不同病毒效應(yīng)子的假定宿主靶點(diǎn)的時(shí)間過(guò)程曲線存在顯著差異。隨著病毒復(fù)制的增加，在3-6 hpi時(shí)，很大一部分相互作用的肺蛋白受到了病毒的影響，這意味著其中一些變化是由病毒效應(yīng)子結(jié)合引起的。病毒介導(dǎo)的不穩(wěn)定可能破壞中心體-微管網(wǎng)絡(luò)的重組，導(dǎo)致24 hpi所見(jiàn)的細(xì)胞周期停滯。相反，響應(yīng)SARSCoV-2感染而上調(diào)的宿主蛋白更有可能與病毒效應(yīng)子形成穩(wěn)定的功能單元。

5、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)揭示失調(diào)的途徑

研究者針對(duì)病毒感染過(guò)程中磷酸化信號(hào)調(diào)控進(jìn)行深入分析：分析24 hpi的病毒膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）上的磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)核衣殼蛋白（N）上有9個(gè)獨(dú)特的磷酸化位點(diǎn)被嚴(yán)重修飾，聚集在RNA結(jié)合（RBD）和二聚化結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)，而病毒膜蛋白（M）的C端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的S213/S214被磷酸化修飾。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明宿主激酶引起的病毒核衣殼蛋白（N）磷酸化可調(diào)節(jié)相分離，從而影響RNA組裝和包裝。利用差異宿主磷酸化蛋白的監(jiān)督聚類和通路分析揭示iAT2細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的整體變化，宿主激酶網(wǎng)絡(luò)分析確定SARS-CoV-2影響iAT2s中的Ser/Thr/Tyr激酶。進(jìn)一步分析并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SARS-CoV-2具有重塑細(xì)胞的生長(zhǎng)、感染重排宿主mRNA剪接、破壞核完整性的功能。

6、與SARS-CoV-2感染相關(guān)的功能網(wǎng)絡(luò)

為了探索SARSCoV-2感染改變肺泡的途徑和過(guò)程，對(duì)差異蛋白和磷酸化蛋白譜進(jìn)行了富集分析，再將FDR<0.1的結(jié)果合并到基于共享組件的更高級(jí)別的模塊中，發(fā)現(xiàn)代謝相關(guān)途徑受到顯著影響，包括脂肪酸代謝改變、線粒體呼吸作用和嘧啶核苷酸生物合成。這些結(jié)果表明宿主代謝發(fā)生重編程，有利于能量和生物質(zhì)合成，以支持病毒復(fù)制。

7、抗病毒藥靶預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

為了探索本數(shù)據(jù)在治療方面的潛力，研究人員檢測(cè)了不同的iAT2宿主磷酸化/蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，以確定潛在的脆弱點(diǎn)，然后在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒應(yīng)答關(guān)聯(lián)子網(wǎng)絡(luò)中推斷出可能的藥靶。最終從7,000多種批準(zhǔn)的藥物中挑選了31種小分子抑制劑進(jìn)行測(cè)試，只有KN-93（CAMK2的選擇性抑制劑）和結(jié)核菌素在Vero E6和iAT2中均能有效抑制SARS-CoV-2復(fù)制。另外還有4種抑制劑（levofloxacin、FRAX486、losmapimod和AZ20）在iAT2s中有效抑制病毒復(fù)制，而在Vero E6細(xì)胞中顯示無(wú)效或弱效（<10％抑制），其中對(duì)MAP激酶抑制劑losmapimod的研究還啟動(dòng)了一項(xiàng)針對(duì)COVID-19的3期臨床試驗(yàn)。

小編小結(jié)

SARS-CoV-2感染破壞了正常肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的分子過(guò)程，導(dǎo)致肺功能受損。闡明病毒在固有肺泡環(huán)境中劫持的細(xì)胞途徑對(duì)于理解發(fā)病機(jī)制和設(shè)計(jì)治療對(duì)策是至關(guān)重要的。為此，研究人員將人原代類AT2細(xì)胞與磷酸化/蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)程分析相結(jié)合，證明了宿主對(duì)肺泡上皮細(xì)胞感染的不同反應(yīng)。該方法繪制了早期感染、病毒顆粒形成前以及以顯性病毒復(fù)制為特征的后期階段的iAT2反應(yīng)，表明隨著病毒破壞宿主程序并重新連接模塊，動(dòng)態(tài)疾病特征會(huì)發(fā)生演變。該研究全面解析了新冠肺炎病毒感染機(jī)制，也為疾病治療策略提供了新的見(jiàn)解。