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DIANA-miTED: a microRNA tissue expression database

microRNA (miRNA) 是短的 (~23nt) 單鏈非編碼 RNA，可作為有效的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑。有關(guān) miRNA 在細(xì)胞類型和組織中的表達(dá)和分布的信息對(duì)于理解它們的功能以及它們作為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)化用途至關(guān)重要。DIANA-mitED 是最全面、最系統(tǒng)的 miRNA 表達(dá)值集合，源自對(duì)來(lái)自序列讀取檔案 (SRA) 和癌癥基因組圖譜 (TCGA) 的 15 183 個(gè)原始人類小 RNA-Seq (sRNA-Seq) 數(shù)據(jù)集的分析。元數(shù)據(jù)質(zhì)量最大限度地提高了表達(dá)圖譜的效用，因此我們手動(dòng)整理了 SRA 和 TCGA 派生信息，以提供全面和標(biāo)準(zhǔn)化的集合，總共包含 199 個(gè)組織、82 個(gè)解剖亞位、267 個(gè)細(xì)胞系和 261 種疾病。miTED 提供跨變量的請(qǐng)求數(shù)據(jù)的表達(dá)式和樣本分布的豐富即時(shí)可視化，以及研究范圍的圖表和圖表，從而實(shí)現(xiàn)高效的內(nèi)容探索。查詢還生成指向最先進(jìn)的 miRNA 功能資源的鏈接，認(rèn)為 miTED 是表達(dá)檢索、探索、比較和下游分析的理想起點(diǎn)，無(wú)需生物信息學(xué)支持或?qū)I(yè)知識(shí)。DIANA-mitED 可在以下位置免費(fèi)獲得?和下游分析，無(wú)需生物信息學(xué)支持或?qū)I(yè)知識(shí)。DIANA-mitED 可在以下位置免費(fèi)獲得?和下游分析，無(wú)需生物信息學(xué)支持或?qū)I(yè)知識(shí)。DIANA-miTED 可在以下位置免費(fèi)獲得http://www.microrna.gr/mited

microRNA (miRNA) 是豐富的調(diào)節(jié)性 RNA，主要指導(dǎo)其靶轉(zhuǎn)錄物的切割、降解和/或翻譯抑制 (?1?)。轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的抑制主要?dú)w因于 miRNA 功能（2）。為此，對(duì)它們?cè)诮M織和細(xì)胞類型中的豐度進(jìn)行準(zhǔn)確編目是了解生理和病理?xiàng)l件下基因調(diào)控和失調(diào)的不可或缺的工具。同樣重要的是，在疾病和健康狀態(tài)之間或在疾病過(guò)程中，組織和生物體液中改變的 miRNA 水平可以區(qū)分疾病或與臨床表型和結(jié)果相關(guān)聯(lián)，突出特定 miRNA 可能攜帶的診斷、預(yù)后或預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物能力(?3、4?)?。_

最初，有限數(shù)量的已知 miRNA 使用低產(chǎn)量方法進(jìn)行量化，包括 Northern 印跡和定量逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR (RT-qPCR) 以及 miRNA 定制微陣列 (?5-7?)。測(cè)序技術(shù)（下一代測(cè)序，NGS）的進(jìn)步極大地提高了數(shù)據(jù)產(chǎn)量，并提供了一種大規(guī)模量化 miRNA 和發(fā)現(xiàn)新的 miRNA 的方法 (?8?)。目前，推導(dǎo) miRNA 豐度估計(jì)值的最先進(jìn)的高通量方法是小 RNA 測(cè)序 (sRNA-Seq)。數(shù)千個(gè)公開可用的 sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集以原始或計(jì)數(shù)格式存儲(chǔ)在存儲(chǔ)庫(kù)中，例如序列讀取檔案 (SRA) (?9?) 和基因表達(dá)綜合 (GEO) (?10 ))，而癌癥基因組圖譜 (TCGA) 等大型聯(lián)盟也生成了大量數(shù)據(jù)集，捕獲了數(shù)千個(gè)患者樣本中的 miRNA 豐度 (?11?)。

創(chuàng)建一個(gè)全面且一致的人類 miRNA 表達(dá)圖譜是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)?(i) 提供了可用的數(shù)據(jù)集以在各種分析級(jí)別（例如原始 FASTQ 文件、計(jì)數(shù)級(jí)別估計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值）進(jìn)行檢索，它們是利用(ii) 可變的 miRNA 注釋來(lái)源和版本，以及 (iii) 不同的量化管道和算法選擇 (?11-14?)。此外，公共存儲(chǔ)庫(kù)和個(gè)人提交者以最低限度的系統(tǒng)方式對(duì)樣本和研究特定的元數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，從而阻礙了將來(lái)自不同來(lái)源的數(shù)據(jù)集集成到一個(gè)統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫(kù)中。

對(duì) miRNA 表達(dá)估計(jì)進(jìn)行編目，尤其是在疾病中，是一項(xiàng)高價(jià)值的科學(xué)工作，在基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究中具有許多潛在應(yīng)用。當(dāng)前可用的實(shí)現(xiàn)在范圍、廣度和功能上有所不同。miRmine (?15?)、HMED (?16?) 和 DASHR2 (?17?) 旨在捕獲各種樣本類型和組織，分別包含 304、401 和 802 個(gè)數(shù)據(jù)集。miRmine 允許單個(gè)/多個(gè) miRNA 查詢并輸出細(xì)胞系或組織的樣本級(jí) RPM 矩陣。DASHR2 專注于小 RNA 的基因組定位，提供有關(guān)其序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息（通過(guò) RNAfold），并為每個(gè)小 RNA 提供靜態(tài)表達(dá)表。YM500v3（18) 僅關(guān)注癌癥，樣本僅來(lái)自 TCGA。SEAWeb (?19?) 是一個(gè) Web 應(yīng)用程序，提供各種分析，例如差異表達(dá)和分類，允許用戶上傳他們的結(jié)果以與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容進(jìn)行比較。SEAWeb 包含來(lái)自 10 種生物的 4258 個(gè)數(shù)據(jù)集（3360 個(gè)人類數(shù)據(jù)集）。最后，DeepBase v3.0 (?20?) 將數(shù)據(jù)分為兩類，即“癌癥數(shù)據(jù)”（來(lái)自 TCGA 和 ICGC）和“組織數(shù)據(jù)”（來(lái)自 SRA/GEO、GTEx、ENCODE 的 500 個(gè)數(shù)據(jù)集）。重要的是，在 DeepBase 中收集的 miRNA 表達(dá)值是指前體或 miRNA 宿主基因，未能在其提供的每種分析類型中提供功能性成熟 miRNA 形式的豐度估計(jì)。在撰寫本文時(shí)，HMED 和 YM500v3 尚未處于功能狀態(tài)。

直到今天，如上所述，大多數(shù)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)要么包含少量數(shù)據(jù)集，要么只關(guān)注或幾乎只關(guān)注 TCGA，這主要是由于實(shí)際原因。TCGA 是一種相當(dāng)統(tǒng)一的資源，而 GEO/SRA 研究在文庫(kù)制備、使用的適配器和樣品質(zhì)量方面極為多樣化。DIANA-mitED 彌補(bǔ)了這一差距，使研究人員能夠在迄今為止最廣泛的文庫(kù)中調(diào)查 miRNA 表達(dá)，并從單一資源執(zhí)行簡(jiǎn)單或復(fù)雜的分析。表中列出了所有可用數(shù)據(jù)庫(kù)的功能和條目表格1，1，它捕獲來(lái)自每個(gè)數(shù)據(jù)源的條目數(shù)、mitED 相對(duì)于該特定源的倍數(shù)變化增加，以及對(duì)每個(gè)資源提供的工具和下游分析的訪問(wèn)。miTED 不僅是迄今為止最大的此類數(shù)據(jù)庫(kù)，而且它提供與 DIANA 工具 cosmos 的直接互連，使研究人員能夠從單個(gè)用戶界面執(zhí)行目標(biāo)預(yù)測(cè)、優(yōu)先級(jí)排序和功能調(diào)查。

為了生成 miTED，我們利用 DIANA-mAP 分析工作流程 ( 21?)對(duì)從 TCGA 和 SRA 檢索到的 >15000 個(gè) sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集進(jìn)行了預(yù)處理和分析。DIANA-mAP 確保對(duì) sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集進(jìn)行全自動(dòng) A 到 Z 統(tǒng)一分析，從原始文件到表達(dá)估計(jì)。我們的結(jié)果發(fā)表在 DIANA-mitED（miRNA 組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)）中，這是一個(gè)健康和疾病狀態(tài)下 miRNA 表達(dá)的在線圖譜（http://www.microrna.gr/mited）。在 miTED 中，用戶可以檢索一個(gè)或多個(gè) miRNA 和/或組織/細(xì)胞系的表達(dá)值，識(shí)別最高表達(dá)的 miRNA，或感興趣的 miRNA 表達(dá)最多的最高組織/細(xì)胞系（圖（圖1）。

方法和結(jié)果

數(shù)據(jù)收集和管理

原始 sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集源自兩個(gè)資源，即 NCBI-SRA (?22?) 和 TCGA 項(xiàng)目 (?23?)。NCBI-SRA 數(shù)據(jù)通過(guò)選擇所有具有圖書館策略的條目和有機(jī)體字段分別為'miRNA-Seq'和'?Homo sapiens?'來(lái)識(shí)別，并在本地檢索。分析中僅包含包含組織或細(xì)胞系信息元數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集。使用 GDC 數(shù)據(jù)傳輸工具檢索 TCGA sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集，以及來(lái)自 GDC 數(shù)據(jù)門戶的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄組元數(shù)據(jù)（24)，同時(shí)檢索了所有可用的樣本和患者元數(shù)據(jù)。研究中只包括了用患者和轉(zhuǎn)錄組元數(shù)據(jù)注釋的 sRNA-seq TCGA 數(shù)據(jù)集。使用定義明確的 sRNA-Seq 分析工作流程 DIANA-mAP (?21?) 分析選定的數(shù)據(jù)集，遵循嚴(yán)格的質(zhì)量控制（在“高通量數(shù)據(jù)分析”部分中描述），結(jié)果收集了 4142 個(gè) NCBI-SRA 和 11 個(gè)041 TCGA 分析了數(shù)據(jù)集。

我們手動(dòng)整理了 NCBI-SRA 和 TCGA 派生的元數(shù)據(jù)信息，以向用戶提供連貫且標(biāo)準(zhǔn)化的集合。生成的集合提供以下元數(shù)據(jù)信息。'Sample_ID' 包含樣品在 SRA（例如 SRR1774098）或 TCGA（例如 TCGA-P8-A5KD-11A-11R-A35M-13）中的識(shí)別碼。'Collection' 保存樣本的原始集合（SRA 或 TCGA）。'Project_ID' 包含樣品在 NCBI-SRA（例如 PRJDB2675）或 TCGA（例如 TCGA-PCPG）中的項(xiàng)目識(shí)別碼。miTED 中的所有條目都強(qiáng)制包含上述信息。此外，每個(gè)條目必須具有“組織或起源器官”或“細(xì)胞系”信息。根據(jù)初始元數(shù)據(jù)，提供以下信息：“組織亞區(qū)域”是指“組織或起源器官”的更具體的解剖位置?！凹膊　卑嘘P(guān)疾病的信息（如果有）。值得注意的是，即使在來(lái)自同一研究的健康樣本（對(duì)照患者）或來(lái)自同一患者的對(duì)照組織區(qū)域（例如來(lái)自癌癥患者的匹配的健康和腫瘤組織）中，疾病元信息也已被注釋。

高通量數(shù)據(jù)分析

使用 DIANA-mAP (v1.0) (?21?) 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，這是一個(gè)強(qiáng)調(diào)預(yù)處理的全自動(dòng)計(jì)算管道，允許用戶執(zhí)行從原始數(shù)據(jù)到量化和差異表達(dá)的 miRNA NGS 數(shù)據(jù)分析以一種簡(jiǎn)單、可擴(kuò)展、高效和直觀的方式。該工具是在 R 中開發(fā)的，并對(duì) miTED 中包含的所有樣本執(zhí)行預(yù)處理、對(duì)齊和量化步驟。

預(yù)處理使用了外部工具 FastQC (v0.11.7) (?25?)、DNApi (v1.1) (?26?) 和 Cutadapt (v1.16) (?27?)。對(duì)原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)量檢查，允許最低 Phred 分?jǐn)?shù)為 10，在未提供適配器時(shí)推斷適配器，并在修剪后使用 18 bp 的最小允許讀取長(zhǎng)度進(jìn)行修剪。隨后使用 Bowtie (v1.1.1) ( 28?)將讀取與 GRCh38 人類基因組組裝進(jìn)行比對(duì)，每次讀取最多允許五個(gè)多圖。最后，通過(guò) miRDeep2 (v0.0.8) (?12?) 使用 miRBase v22 發(fā)夾和成熟的人類 miRNA 形式 (?29 ) 對(duì)對(duì)齊的讀數(shù)進(jìn)行量化)，并在對(duì)齊過(guò)程中允許前體上的一個(gè)錯(cuò)配。其余 DIANA-mAP 和外部工具的參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

NCBI-SRA 數(shù)據(jù)集使用從可用的元數(shù)據(jù)派生的適配器信息進(jìn)行分析，盡管此類信息非常稀缺。sRNA-Seq 數(shù)據(jù)集有時(shí)表現(xiàn)出特別低的比對(duì)率，甚至不到一半的讀數(shù)可以分配給 miRNA，由于樣品污染或其他一些生物學(xué)解釋，但量化結(jié)果仍然可以被認(rèn)為是可靠的 (?30）。在我們的案例中，大量分析了數(shù)千個(gè)樣本，并且在許多情況下都缺少適配器信息。為了避免由于不正確的適配器推斷而包含錯(cuò)誤的結(jié)果，我們選擇保守地僅包含至少 50% 的預(yù)處理讀數(shù)分配給已知 miRNA 的樣本。相同的參數(shù)用于分析 TCGA 數(shù)據(jù)集，導(dǎo)致平均 79.2% [76.6–81.9, 95% 置信區(qū)間] 率或分配給已知 miRNA 的預(yù)處理讀數(shù)。讀取計(jì)數(shù)和每百萬(wàn)讀取 (RPM) 單位直接從 DIANA-mAP 結(jié)果中檢索，而 log?2(RPM + 1) 值是專門為可視化目的計(jì)算的。在對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換期間在所有 RPM 值上加 1 是為了避免因?qū)?shù)轉(zhuǎn)換零導(dǎo)致的未定義值。

數(shù)據(jù)庫(kù)架構(gòu)和實(shí)現(xiàn)

DIANA-miTED 是一個(gè)使用 MVC 架構(gòu)構(gòu)建并托管在 Apache?HTTP服務(wù)器 2.4 上的 NoSQL 數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)訪問(wèn)層（后端）由 MongoDB（https://www.mongodb.com/）和 PHP 框架 Laravel 8（https://laravel.com/）（PHP 7.2）組成，而表示層（ front-end) 是使用 Angular 9.1 (?https://angular.io/?) 和 Angular Material UI 庫(kù) (?https://material.angular.io/?) 設(shè)計(jì)的。miTED 的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在 NoSQL 數(shù)據(jù)庫(kù)集合中，Laravel 處理與它們的連接以進(jìn)行存儲(chǔ)和/或檢索。最后，在表示層，使用 Chart JS (?https://www.chartjs.org/) 和 Plotly JavaScript 開源圖形庫(kù) (?https://plotly.com/javascript/?)，而 Flourish (?https://flourish.studio/?) 用于更復(fù)雜的可視化。

數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容

分析來(lái)自 15183 個(gè) sRNA-seq 數(shù)據(jù)集的超過(guò) 1200 億個(gè)讀數(shù)，其中 4142 個(gè)（27.3%）來(lái)自 NCBI-SRA，11041 個(gè)（72.7%）來(lái)自 TCGA，產(chǎn)生超過(guò) 1.2 億個(gè)表達(dá)值（120978144），作為讀取計(jì)數(shù)、每百萬(wàn)讀取 (RPM) 和日志2?(RPM)。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)自 261 種人類病理學(xué)的疾病樣本的 12400 個(gè)數(shù)據(jù)集，以及來(lái)自健康樣本的 1386 個(gè)數(shù)據(jù)集。14 146 個(gè)樣本來(lái)自 199 個(gè)組織/器官，1037 個(gè)樣本來(lái)自 267 個(gè)細(xì)胞系。性別比例在 miTED 內(nèi)是平衡的，有 6751 個(gè)女性樣本、6123 個(gè)男性樣本（2309 個(gè)未注釋條目）。

模擬接口

查詢 miTED

實(shí)現(xiàn)了一個(gè)友好的在線圖形用戶界面，使用戶能夠搜索、瀏覽和元分析這個(gè)廣泛的集合，而不需要生物信息學(xué)支持或?qū)I(yè)知識(shí)。DIANA-miTED通過(guò)Querying?DB頂部菜單提供三個(gè)主要查詢頁(yè)面，即Multi-query、Top-miRNAs?和Top-sites 。多查詢頁(yè)面提供了探索和比較特定 miRNA 在組織或細(xì)胞系中的表達(dá)的能力。Top-miRNAs頁(yè)面返回特定組織或細(xì)胞系中表達(dá)最高的 miRNAs?。最后，熱門網(wǎng)站頁(yè)面提供了特定查詢 miRNA 表達(dá)最多的組織或細(xì)胞系。所有生成的結(jié)果和圖表都可以通過(guò)專用的下載按鈕（數(shù)據(jù)表和圖表）下載，無(wú)需登錄、應(yīng)用程序或驗(yàn)證程序。

在Multi-query頁(yè)面中，用戶可以查詢、檢索和比較組織或細(xì)胞系中一種或多種（甚至全部）miRNA 的表達(dá)。專用搜索框允許自由文本搜索和選擇特定組織或細(xì)胞系和 miRNA（圖（圖 2A）。2A）。多查詢表單提供了將搜索限制為特定疾病的機(jī)會(huì)，僅包括來(lái)自 SRA 或 TCGA 數(shù)據(jù)收集的結(jié)果，根據(jù)健康狀況（即“健康”或“疾病”）檢索數(shù)據(jù)，并在其中選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)單元讀取計(jì)數(shù)、RPM 和日志2?(RPM)。結(jié)果分為三個(gè)不同的部分。(A) 第一部分專門用于可視化檢索到的結(jié)果。分組箱線圖可以比較特定組織/疾病中的 miRNA 豐度（圖（圖 2C）。2C）。此外，通過(guò)描繪組織-疾病關(guān)系的桑基圖和性別、采集和健康狀況的餅圖探索樣本分布（圖（圖 2D）。二維）。(B) 第二部分滿足 miTED 結(jié)果與每個(gè) miRNA 的相關(guān) DIANA 資源（工具和數(shù)據(jù)庫(kù)）的互連。miTED 為每個(gè)輸入 miRNA 提供指向 DIANA-microT-CDS (?31?) 的超鏈接，這是一個(gè)預(yù)測(cè) miRNA 目標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，DIANA-Tarbase v.8 (?32?) 一個(gè)實(shí)驗(yàn)支持的 miRNA 目標(biāo)的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，DIANA-LncBase v.3 (?33），一個(gè)參考存儲(chǔ)庫(kù)，在長(zhǎng)非編碼 RNA 上具有實(shí)驗(yàn)支持的 miRNA 靶標(biāo)，以及 DIANA-miRPath v.3（34)，一個(gè)專門用于評(píng)估 miRNA 調(diào)節(jié)作用和識(shí)別受控途徑的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器。(C) 最后，在第三部分中，提供了一個(gè)數(shù)據(jù)表，其中包含樣本元數(shù)據(jù)以及用戶請(qǐng)求的 miRNA 的表達(dá)，如材料和方法部分所述（圖（圖2B2B）。

Top-miRNAs頁(yè)面是 miTED 資源中的第二個(gè)查詢頁(yè)面。通過(guò)此頁(yè)面，用戶可以搜索特定組織或細(xì)胞系中表達(dá)最高的 miRNA。顯示的結(jié)果包括以降序顯示所有 miRNA 表達(dá)的數(shù)據(jù)表和描繪所需組織或細(xì)胞系中最高表達(dá) miRNA 的條形圖。

Top-sites頁(yè)面專門用于檢索特定 miRNA 最豐富的組織或細(xì)胞系。與Top-miRNAs頁(yè)面類似，結(jié)果包括一個(gè)表格，其中包含按降序排列的組織/細(xì)胞系的表達(dá)值，以及一個(gè)描述輸入表達(dá)最多的頂部組織或細(xì)胞系的條形圖。

miTED 中的可視化選項(xiàng)

DIANA-miTED 還通過(guò)其Visualizations菜單提供三個(gè)可視化頁(yè)面。第一頁(yè)，“組織 - 亞區(qū)域 |?Graph Network'，提供了一個(gè)圖網(wǎng)絡(luò)，描述了組織或起源器官與組織子區(qū)域之間的關(guān)系（圖（圖 3A）。3A）。它是一個(gè)交互式圖表，提供突出顯示和移動(dòng)節(jié)點(diǎn)的能力，以探索它們之間的互連程度?！癟CGA Projects Exploration”頁(yè)面包含用于分別探索 TCGA 數(shù)據(jù)集的組織-疾病和組織-性別關(guān)系的?；鶊D（圖（圖 3B）。3B）。?；鶊D也是交互式的，可以探索每個(gè)類別中的樣本分布。最后，“數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)”頁(yè)面提供了描述整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容的補(bǔ)充圖表。