Frdbio ?細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法)

貨號：FrdE00018

試劑盒組分

名稱

規(guī)格

Frdbio ?Annexin ? V-FITC

100 ul

5×Binding ? buffer

1.5ml*2

Propidium Iodide

200ul

?

一.產(chǎn)品說明

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故

可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V 被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液,碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的 細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

二.產(chǎn)品保存方法

各組分應(yīng)在2-8℃條件下避光保存，有效期2年。

?

三.使用方法

1.?懸浮細(xì)胞離心（2000rpm 離心5min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；

2.?用PBS 洗滌細(xì)胞二次（2000rpm 離心5min）收集1-5×105?細(xì)胞；

3.?加入500μL 的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；

4.?加入5μL Annexin V-FITC 混勻后，室溫避光，反應(yīng)15-30min;

5.?用PBS 洗滌細(xì)胞一次（2000rpm 離心5min），500μL PBS 重懸細(xì)胞；

6.?加入 10 μL Propidium lodide；

7.?室溫，避光，孵育5min，上機檢測。

8.?注：請在1 hour 內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

a.?熒光顯微鏡觀察

1)?滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；

2)?對于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；

1?將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；

2?用PBS 洗滌細(xì)胞兩次；

3?在500μL 的Binding Buffer 中加入5μL Annexin V-FITC 和10ul Propidium lodide混勻；

4?將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋；

5?避光、室溫反應(yīng)5 min。

3)?將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（FITC）觀察，Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色。

b.?流式細(xì)胞儀分析

1)?用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=525nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光通過

FITC?通道（FL1）檢測。

?

四.注意事項

1.?微量試劑取用前請離心集液。

2. Annexin V-FITC?避光保存及使用。

3.?本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×105，，不推薦用于檢測組織樣本。

4.?推薦使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽性，而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止進(jìn)一步的損傷。

5.?細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

6.?因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照，進(jìn)行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。

?

?

?

*本試劑僅供實驗室研究使用