定點(diǎn)誘變是一種高度通用的技術(shù)，可用于以定制的方式引入特定的核苷酸取代（或缺失）。 該方法可用于常規(guī)克?。ㄒ牖蛉コ拗菩晕稽c(diǎn)）、調(diào)控元件作圖（突變報(bào)告構(gòu)建體中的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子）、蛋白質(zhì)功能分析（進(jìn)行丙氨酸掃描誘變或關(guān)鍵殘基的靶向取代） )，以及 SNP 分析（在質(zhì)粒環(huán)境中引入自然發(fā)生的 SNP）。 該技術(shù)在這個(gè) CRISPR 時(shí)代也高度相關(guān)； 定點(diǎn)誘變通常適用于質(zhì)粒，但也可能有助于基因組編輯。 通常通過 CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的同源定向修復(fù) (HDR) 將定制突變引入內(nèi)源性 DNA。 這種定點(diǎn)基因組編輯需要與內(nèi)源靶點(diǎn)具有高度同源性的模板，但為了便于修復(fù)，模板應(yīng)能抵抗 Cas9 切割。 如果質(zhì)粒包含模板，則可以使用定點(diǎn)誘變來突變 PAM 序列（對(duì) Cas9 切割至關(guān)重要的 NGG 序列），從而使生成的結(jié)構(gòu)對(duì) Cas9 誘導(dǎo)的切割具有抗性。

圖1.定點(diǎn)誘變技術(shù)

簡而言之，可以在擴(kuò)增整個(gè)質(zhì)粒模板的 PCR 方案中使用引物（具有所需突變）將點(diǎn)突變引入質(zhì)粒。 使用甲基化依賴性核酸內(nèi)切酶（即 DpnI）去除母體模板，并用耐核酸酶的帶切口質(zhì)粒（PCR 產(chǎn)物）轉(zhuǎn)化細(xì)菌。 從所得菌落中分離質(zhì)粒，并篩選所需的修飾。 最后，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)所需的修飾和沒有額外的修飾。

圖2.質(zhì)粒的定點(diǎn)誘變。 A) 誘變質(zhì)粒的產(chǎn)生。 PCR 引物（綠色）擴(kuò)增質(zhì)粒模板（藍(lán)色），并引入限制性位點(diǎn)“A*”（除了父載體中已有的“A”位點(diǎn)）。 還顯示了位于目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)的“B”限制位點(diǎn)。 在 PCR 擴(kuò)增后，通過 DpnI 限制性消化去除模板，只留下誘變質(zhì)粒。 盡管人們普遍認(rèn)為 PCR 反應(yīng)的最終產(chǎn)物是帶有交錯(cuò)切口的雙鏈環(huán)狀 DNA 片段，但最近的數(shù)據(jù)表明 PCR 最終產(chǎn)物是線性雙鏈 DNA 片段，具有同源末端。 這些同源末端在體內(nèi)重組，得到如圖所示的最終環(huán)狀質(zhì)粒產(chǎn)物。 B) 為目標(biāo)突變篩選回收的質(zhì)粒。 預(yù)期限制性分析結(jié)果（左）和驗(yàn)證 PCR 后進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP) 分析（右）的凝膠電泳圖。 與親代質(zhì)粒消化產(chǎn)物（藍(lán)色）相比，當(dāng)用酶“A”消化定點(diǎn)誘變產(chǎn)物（綠色）時(shí)，引入限制性位點(diǎn)“A*”會(huì)產(chǎn)生額外的條帶。 用酶“B”消化檢測(cè)引物多聚化（紫色），下部條帶（包含突變的質(zhì)粒部分）大小的增加證明了這一點(diǎn)。 使用 (A) 中箭頭指定的引物通過 PCR 篩選可以獲得類似的結(jié)果。