腺病毒滴度檢測(cè)采用TCID50法：

滴度單位：PFU/mL，是空斑形成單位，為Plaque Forming Unit per?mL的縮寫。

I. 細(xì)胞準(zhǔn)備

①培養(yǎng)293A 細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為80-90 % 時(shí)，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞量；

②用含有5% FBS的 DMEM 培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，按每孔100 μL（1×10 4個(gè)細(xì)胞）加入2個(gè)96孔板；

II. 加病毒

②?????? 將96孔板中的11、12兩列各加入100 μL 5% FBS的 DMEM，做陰性對(duì)照；

②96孔板中的A-H排，依次各加100 μL 標(biāo)記為8個(gè)連續(xù)梯度稀釋的病毒樣品溶液，蓋上第一個(gè)板并在37°C CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

③同樣步驟操作第二塊板；

實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)板的結(jié)構(gòu)如下圖：

III. 觀察結(jié)果并計(jì)算滴度

①將96孔板置于37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，從第3天到第10天觀察細(xì)胞狀況。

②第10天分析、記錄CPE結(jié)果：

CPE應(yīng)在10天之內(nèi)出現(xiàn)。第10天在顯微鏡下觀察每孔CPE情況，并與陰性對(duì)照的一排對(duì)比，記錄每排樣品的陽(yáng)性孔數(shù)。

注意：如有一個(gè)板被污染，實(shí)驗(yàn)必須重做

③病毒活性計(jì)算公式：

對(duì)于100 μL樣品，滴度T＝101+d（s-0.5）

d＝log10稀釋度＝1（對(duì)于10倍的稀釋度而言）

s＝陽(yáng)性比率之和（從第一個(gè)10倍稀釋度算起）

將TCID50/mL轉(zhuǎn)換成PFU/mL：

T＝a×10bTCID50/mL＝a×10b-0.7PFU/mL

兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的滴度值應(yīng)相差≤100.7

以Ad-GFP滴度測(cè)定為例： 測(cè)定結(jié)果為1.99×1011PFU/mL

滴度： T=101+(10.5-0.5)=1011.0TCID50/100uL

將TCID50/mL換算成PFU/mL

T=1011.0-0.7/100uL=1010.3/100uL=1.99×1010PFU/100uL =1.99×1011PFU/mL

注意事項(xiàng)：

①稀釋病毒液時(shí)要充分混勻。 每次吸病毒液時(shí)要更換Tip頭，以防導(dǎo)致稀釋不準(zhǔn)確。

②本檢測(cè)須做兩組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩組實(shí)驗(yàn)可在同一天進(jìn)行，也可在不同天進(jìn)行。

Q&A:

Q1:?protocol中所說(shuō)的CPE和TCID50具體是指什么？

A1:CPE（cytopathic effect）指的是病毒感染細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)，TCID50（tissue culture infective dose 50%）指的是半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，即50%的細(xì)胞發(fā)生CPE時(shí)的病毒稀釋度。

Q2:滴度單位VP、PFU、IU分別是什么?

?A2:不同的概念緣于不同的滴度測(cè)定方法，這些方法包括2類：物理方法（VP）和生物學(xué)方法（GTU、PFU、TCID50）。

VP：病毒顆粒（viral particle），是“活”（有感染性） 和 “死”（無(wú)感染性）的腺病毒顆粒的總量。

PFU：空斑形成單位（plaque formation unit），是有感染性的 “活”的腺病毒的總量，即腺病毒得活性單位。

IU：感染單位（infectious unit），和PFU一樣，是另一種腺病毒活性單位。測(cè)定方法是TCID50法。

Q3： TCID50測(cè)定腺病毒滴度可以用293T細(xì)胞嗎？

A3：不可以，腺病毒確實(shí)E1A基因，該基因與病毒復(fù)制相關(guān)，293A細(xì)胞是反向表達(dá)E1A基因的細(xì)胞系，腺病毒感染后可以復(fù)制擴(kuò)增，293T不能反向表達(dá)該基因，腺病毒感染后不能復(fù)制擴(kuò)增。

?

?