生物制品是指利用生物體（如微生物、寄生蟲等）、生物組織或動物毒素等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的原理與方法制得的具有疾病治療效用的生物活性制劑。生物制品可能由糖、蛋白質(zhì)或核酸組成，或者這些物質(zhì)的復(fù)雜組合，也可能是如細(xì)胞和組織這樣的活體實(shí)體，主要包括疫苗、血液及血液成分、抗原、單克隆抗體以及重組治療性蛋白等制品。分子量是蛋白質(zhì)主要特征參數(shù)之一，是確定一種蛋白、進(jìn)行蛋白質(zhì)后續(xù)研究活動的重要前提。因此準(zhǔn)確有效地對蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行測定十分重要。

百泰派克生物科技BTP提供基于凝膠電泳法、MALDI-TOF測分子量、LC-MS測分子量、SEC分子量分布等方法的分子量分析服務(wù)。

一、凝膠電泳法分子量分析

1. 原理:

SDS-PAGE凝膠電泳是一種基于電泳分離的技術(shù)，在這種技術(shù)中，SDS（十二烷基硫酸鈉）被用作蛋白質(zhì)分子的表面活性劑，以便將蛋白質(zhì)分子的電荷中和，從而使它們按照大小分離。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器:

電泳儀

3. 應(yīng)用:

可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量與遷移率做標(biāo)曲，對目的蛋白的分子量進(jìn)行計(jì)算（10-200kDa），還可以根據(jù)條帶的深淺用軟件進(jìn)行純度的計(jì)算。優(yōu)勢是耗時短、成本低。

4. 案例示意：

二、 MALDI TOF法分子量分析

1. 原理:

MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜）一種軟電離生物質(zhì)譜,電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子,而使生物分子電離,離子在電場作用下加速飛過飛行管道,根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，由于得到離子帶單電荷，不需要通過計(jì)算即可得到分子量結(jié)果。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器:

microflex? MALDI-TOF（Bruker）

3. 應(yīng)用:

適用于混合物及生物大分子的測定，有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、質(zhì)量范圍寬等優(yōu)勢；不適用于高分辨質(zhì)譜的含復(fù)雜糖基化、PEG修飾等樣品可以用MALDI-TOF檢測。

4. 案例示意:

圖中橫坐標(biāo)為分子量，縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度

三、 LC-MS分子量分析

1. 原理:

樣品溶液在電場的作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，在向質(zhì)量分析器移動的過程中，經(jīng)過電離，最后得到帶單電荷或多電荷的離子。得到的不同電荷離子經(jīng)過去卷積計(jì)算得到最終的蛋白質(zhì)分子量。

左圖為樣品進(jìn)質(zhì)譜過程，右圖為帶不同電荷的質(zhì)譜圖

2. 實(shí)驗(yàn)儀器:

? 高效液相色譜儀：Ultimate 3000（Thermo Fisher Scientific）

? 電噴霧-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀：AB SCIEX TripleTOF 5600（AB SCIEX）

3. 應(yīng)用:

高分辨率質(zhì)譜可以對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行精確分子量測定（10-250 kDa），精度達(dá)到1Da，可分析蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)（比如磷酸化、小分子藥物結(jié)合等），并對這些修飾情況進(jìn)行相對定量分析；還可以對抗體的原始、還原、切糖分子量進(jìn)行檢測，以及抗體藥物偶聯(lián)的檢測。優(yōu)勢是高靈敏度、高分辨率、高準(zhǔn)確度。

4. 案例示意:

如圖為去卷積后的分子量，橫坐標(biāo)為分子量，縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度

四、 SEC分子量分布法

1. 原理：

SEC的分離機(jī)理是不同分子量大小的蛋白在通過多孔載體時所用時間不同，樣品按分子尺寸由大到小的順序依次流出。通過標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和信號強(qiáng)度即可計(jì)算樣品的分子量分布。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：

高效液相色譜（紫外檢測器）：Waters 2695/2996

3. 應(yīng)用：

可以對混合樣品的分子量進(jìn)行檢測，適用于較為復(fù)雜的混合樣品。

4. 案例示意：

如圖橫坐標(biāo)為出峰時間，縱坐標(biāo)為紫外信號值，表格為分子量分布

這四種方法有各自的優(yōu)勢和局限，比如想要快速得到樣品的大致分子量和純度，可以采用凝膠電泳法，想要得到較為準(zhǔn)確的分子量，且樣品量較低，可以使用LC-MS進(jìn)行檢測，如果目的蛋白含有較多的糖基化或PEG修飾，或者分子量在150kDa以上，可以使用MALDI-TOF進(jìn)行檢測，如果是較為復(fù)雜的混合樣品，需要得到樣品的大致分子量情況，可以用SEC分子量分布的方法進(jìn)行檢測。

常見問題

問題1：高分辨質(zhì)譜測定分子量的優(yōu)勢和局限分別是什么？

回答：優(yōu)勢：具有高靈敏度、分辨率和準(zhǔn)確度，需要的樣品量較少，可以檢測蛋白質(zhì)的精確分子量，可以分析較為復(fù)雜的混合樣。局限：對于含大量糖基化和較多修飾的樣品檢測效果較差。

問題2：為什么用高分辨質(zhì)譜只檢測到單體分子量，沒檢測到非共價多聚體分子量？

回答：常規(guī)檢測方法樣品前處理過程和洗脫過程中會將非共價多聚體打成單體，檢測非共價多聚體分子量需要使用native ms的方法進(jìn)行檢測。