實驗原理

酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosrbent Assay, 簡稱 ELISA），其基礎(chǔ)原理是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。

結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上 。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。?

照不同的原理及操作，將ELISA大致分為四類：直接ELISA，間接ELISA，夾心ELISA和競爭抑制ELISA。

1.?直接 ELISA

直接ELISA是所有ELISA中步驟最簡單的一種，方法為將抗原按一定的比例用包被緩沖液稀釋好包被到固相載體上，包被完成后簡單洗滌，再加入封閉液，封閉結(jié)束后再次洗滌除去多余封閉液，加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體，37℃溫育1h或4℃溫育過夜后，洗滌除去多余的抗體，加入底物顯色并判讀結(jié)果。最后顯色的深淺與加入的酶標(biāo)抗體量成正比。

2. 間接 ELISA

間接 ELISA 的步驟與直接 ELISA 步驟前面的部分基本一致，不同的是，間接 ELISA 中與包被好的抗原結(jié)合的不是酶標(biāo)抗體，而是非酶標(biāo)的（一抗），另外再引入經(jīng)過酶標(biāo)的二抗與一抗特異性結(jié)合。最后加入底物顯色并判讀結(jié)果。

3.?夾心 ELISA

• 3.1 直接夾心?ELISA

直接夾心ELISA又分為雙抗體夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。雙抗體夾心ELISA的方法是：將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，溫育后加入第二種抗體（檢測抗體），捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗，也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗，但是檢測抗體需要經(jīng)過酶標(biāo)。雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗夾心基本相同，不同的是用于捕獲和檢測的是抗原，待檢對象是抗體。

• 3.2 間接夾心?ELISA

間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，溫育，洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標(biāo)，作為檢測抗體），最后加入酶標(biāo)二抗（特異性識別檢測抗體），再加底物顯色。

4.?競爭抑制 ELISA

競爭抑制ELISA又稱封閉ELISA，其主要原理是用待檢抗原或抗體去干擾已經(jīng)預(yù)先設(shè)計好的體系，最終顯色的結(jié)果與待檢抗原或抗體的干擾程度成負(fù)相關(guān)。大致分為直接競爭抑制ELISA、間接競爭抑制ELISA、夾心競爭ELISA等特殊的ELISA方法。

• 4.1 直接競爭抑制ELISA

直接競爭抑制 ELISA 中，預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢對象是抗原，則待檢抗原就與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)構(gòu)酶標(biāo)抗體；如果待檢測對象是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。洗滌過程就可以洗掉被競爭下的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色。最終顯色的結(jié)果與待檢原（或抗體）量成反比。

• 4.2?間接競爭抑制ELISA

間接競爭抑制ELISA中，將抗原包被于固相載體上，依次加入特異性的抗體以及此抗體對應(yīng)的酶標(biāo)二抗作為預(yù)制備的體系。實驗時，加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），待檢標(biāo)本中的抗原（或抗體）就和預(yù)制備體系中固相載體上結(jié)合的抗原（或抗體）競爭結(jié)合特異性的抗體（或固相載體上結(jié)合的抗原）。

作者：海星生物

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