細胞培養(yǎng)中細胞發(fā)生污染就是一個災(zāi)難，既耽誤時間又傷神，熟練的無菌操作能避免許多問題，但早期檢測污染也是一種可以預(yù)警的方法。對于培養(yǎng)箱中的每瓶細胞都要注意觀察，要養(yǎng)成習(xí)慣，每次打開培養(yǎng)箱時，迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細胞都可能引起污染。

怎樣識別污染??

一、肉眼觀察

肉眼觀察，把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來，對著光線檢查。

渾濁情況。即使細胞密度很高，培養(yǎng)基也應(yīng)該是透明的。輕輕移動或晃動培養(yǎng)瓶，觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會由紅變黃，而堿性條件下會變成紅紫色。細菌污染常常會使培養(yǎng)基變成黃色，真菌污染會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

聞！當(dāng)然不能打開瓶子去聞，把鼻子貼在瓶口聞，許多污染發(fā)生以后都會散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味，甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察

顯微觀察。在倒置顯微鏡下，先用低倍(10X) 再用高倍(40X) 物鏡（總放大倍數(shù)為400) 觀察細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞。

其他有機體。在低倍鏡下，真菌的菌絲體成長棒狀，并橫穿整個視野，還可以觀察到酵母，有時呈小圓球形，有時還有芽。在高倍鏡下可以觀察到細菌，它們可能是棒狀或球狀，單獨成鏈或成團存在，它們也可能和細胞混在一起，并且明顯處于細胞內(nèi)部，有些細胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀察時可能每兩個視野才出現(xiàn)一個污染（當(dāng)然也算被污染了?。?，而且可能污染物是可以運動的。

損傷細胞。感染會殺死細胞，可能導(dǎo)致每個細胞都裂解和／或細胞層從附著物上完全剝離，更可能的是細胞變得不規(guī)則（或大或小），在低倍鏡下是黑色的粒狀。

懸浮培養(yǎng)細胞比貼壁培養(yǎng)細胞更加難以顯微觀察，尤其是高倍顯微鏡下。

• 將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺上，靜置一會。

• 將焦距對準(zhǔn)器皿的底部，觀察那些輕微附著的細胞，因為它們可能已經(jīng)接觸到了微生物。

• 對準(zhǔn)整個培養(yǎng)瓶焦距，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細胞的時候，用細聚焦調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)，仔細檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

三、交叉污染

細胞還可能被別的細胞污染，這種交叉污染可能更廣泛，許多實驗人員在不經(jīng)意之間培養(yǎng)、使用和凍存了其他的細胞。

如何避免交叉污染：

• 只從有保障的地方得到細胞，或者自已檢查細胞。

• 不要同時操作多株細胞。不要把多種培養(yǎng)瓶同時放在超凈臺內(nèi)。

• 不要使用同一個移液管操作多種細胞。

• 不同細胞株不要使用同一瓶培養(yǎng)基或胰蛋白酶。

• 操作后不要把移液管放回培養(yǎng)基的瓶中。

• 培養(yǎng)維護時，使用栓塞式移液管。

四、支原體污染

支原體污染是一種很難發(fā)現(xiàn)卻經(jīng)常存在的問題。

• 支原體是最小的（0.3 μm）能夠自我復(fù)制的有機體，倒置顯微鏡下通常觀察不到。

• 支原體沒有細胞壁，對常用的抗生素不敏感。支原體感染是極為不易察覺的，可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細胞正常功能喪失的時候，才意識到是發(fā)生了支原體感染。

• 在沒有采用特殊的染色方法，也沒有觀察到病變的情況下，實驗總是不成功，就應(yīng)懷疑被支原體污染。預(yù)防支原體污染的惟-途徑是經(jīng)常對細胞進行篩選。

• 支原體個體很小，需要使用透射電鏡才能清晰看到其結(jié)構(gòu)及分布。

注意：如果你發(fā)現(xiàn)了支原體污染

• 最好的方法是立即把細胞丟棄，從新復(fù)蘇。

• 可以不理會它。

• 可以采取某些挽救措施，但是會很困難，只適用于那些不可代替的細胞。最簡單的方法是訂購支原體清除試劑盒。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

• 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心，用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細胞，滴一滴到載玻片，蓋上蓋玻片制成濕涂片；或涂片、固定并染色（甲基蘭或革蘭氏染液），在高倍鏡下觀察。

• 將細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線， 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落，那么細胞被污染了。

• 取1 ml 的細胞培養(yǎng)液至無菌的微量離心管中， 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物，做濕涂片顯微鏡觀察。

  
  

作者：海星生物

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