豬肉富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，是世界上除家禽外消費量最大的肉類。與冷凍肉相比，冷藏(4°C)豬肉因其美味和高營養(yǎng)價值而成為最常食用的鮮肉，但是隨著儲存時間的延長，冷藏豬肉的新鮮度會因腐敗和變質(zhì)而顯著下降，從而引發(fā)經(jīng)濟損失和食品安全問題。腐敗過程中脂質(zhì)氧化、自身酶解反應(yīng)和微生物活動會產(chǎn)生大量的低分子量代謝物，這些代謝物的分析和表征可以為肉類控制和質(zhì)量評估提供重要信息。因此，準(zhǔn)確識別豬肉儲存過程中代謝產(chǎn)物的潛在標(biāo)志物是監(jiān)測肉制品質(zhì)量的關(guān)鍵。

2023年6月，中國農(nóng)科院團隊在Food Chemistry（IF 8.8）上發(fā)表了題為“Insight from untargeted metabolomics: Revealing the potential marker compounds changes in refrigerated pork based on random forests machine learning algorithm”的文章。該文主要結(jié)合非靶向代謝組和隨機森林機器學(xué)習(xí)算法分析了冷藏豬肉中的非揮發(fā)性化合物，發(fā)現(xiàn)D -木糖、黃嘌呤和丙酮醛可能是影響冷藏豬肉新鮮度的關(guān)鍵標(biāo)志化合物，并創(chuàng)新性地提出了戊糖相關(guān)代謝在豬肉腐敗中的關(guān)鍵作用。該研究提供了豬肉代謝產(chǎn)物的全面概況，并為識別豬肉中的生物標(biāo)志物提供了新的思路，可用于肉類和肉制品的質(zhì)量評價。中科新生命參與了該研究中非靶向代謝組檢測的相關(guān)工作。

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研究材料

豬腰最長肌（LL）

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?技術(shù)路線

步驟1：新鮮度相關(guān)指標(biāo)分析；

步驟2：非靶向代謝組學(xué)分析；

步驟3：篩選冷藏豬肉中潛在的生物標(biāo)志物；

步驟4：代謝途徑分析；

步驟5：新鮮度生物標(biāo)志物的鑒定。

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?研究結(jié)果

1. 新鮮度相關(guān)指標(biāo)分析

將豬腰最長肌分成六塊，分別在4℃下用好氧膜密封0天（約死后24小時）、1天、3天、7天、9天和11天，每個保存時間取8份肉樣品作為重復(fù)。作者首先研究了作為豬肉保鮮過程中重要指標(biāo)的pH值和顏色(L*、a*、b*)的變化，發(fā)現(xiàn)豬肉的pH值、L*值和b*值基本保持穩(wěn)定（p>0.05），而a*值則先升高后降低（p<0.05）。隨后，對總揮發(fā)性堿性氮值（TVB-N）和總活菌計數(shù)值（TVC）的變化進(jìn)行了評估，以確定蛋白質(zhì)分解和細(xì)菌生長情況，發(fā)現(xiàn)豬肉樣品的TVB-N和TVC值隨儲存時間的延長呈增加趨勢，且豬肉在簡單包裝的常規(guī)儲存條件下(4℃)的保質(zhì)期可達(dá)7天。

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2. 非靶向代謝組學(xué)分析

采用非靶向UHPLC-MS/MS技術(shù)評價了豬肉在儲存過程中非揮發(fā)性成分的變化，使用方差分析（p<0.05）研究豬肉樣品中代謝物豐度的差異，共篩選出873種差異代謝物，主要包括脂類和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環(huán)化合物、有機氧化合物、苯類化合物等。冷藏豬肉中兩種主要成分的含量包括脂質(zhì)和類脂分子(261種)、有機酸及其衍生物(234種)在儲存7天后含量明顯增加，而作為脂類和類脂分子主要成分的甘油磷脂在儲存過程中則保持穩(wěn)定。同時，檢測到氨基酸、多肽和類似物189種，它們的含量在儲存過程中不斷增加，證實了豬肉蛋白質(zhì)的持續(xù)降解（圖1）。

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圖1?基于方差分析的鑒定代謝物豐度分析

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3. 篩選冷藏豬肉中潛在的生物標(biāo)志物

為了進(jìn)一步評估不同豬肉樣品中代謝物之間的差異，使用了隨機森林模型分析。發(fā)現(xiàn)有40種關(guān)鍵的非揮發(fā)性化合物，可大大提高隨機森林分類的準(zhǔn)確率，可作為區(qū)分豬肉儲存條件的潛在標(biāo)志物。此外，構(gòu)建ROC曲線評估40種標(biāo)志物的性能，發(fā)現(xiàn)40種潛在標(biāo)志物的AUC值為0.964，表明隨機森林模型識別的標(biāo)志物具有良好的預(yù)測性能。作者還分析了40種潛在標(biāo)志物在儲存過程中的特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在冷藏豬肉中，28種標(biāo)志物的相對豐度隨存放時間的增加而增加，6種標(biāo)志物的相對豐度隨存放時間的延長而減少。如小分子肽（Gly-Asn-Arg、Leu-Tyr-Arg、Glu-Ala-Lys、Cys-Pro-Arg、Ala-Ala和Arg-Phe）的含量在儲存期發(fā)生了顯著變化（p<0.05），D-木糖、黃嘌呤和丙酮醛的相對含量隨著儲存天數(shù)的延長而增加（圖2）。

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圖2 篩選潛在生物標(biāo)志物

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4. 代謝途徑分析

方差分析篩選的差異物主要顯著富集在41個代謝途徑（p<0.05）中，涉及肽和氨基酸、核苷酸和碳水化合物等途徑，也證實了氨基酸代謝和核苷酸代謝是冷藏豬肉中蛋白質(zhì)降解和氨基酸運輸?shù)年P(guān)鍵代謝途徑。40種潛在生物標(biāo)志物主要富集在10種不同類型的關(guān)鍵通路（p<0.05）上，與戊糖代謝相關(guān)的代謝變化如D -木糖含量上調(diào)，D -葡萄糖和D -葡萄糖-1,5-內(nèi)酯含量波動增加。基于多變量數(shù)據(jù)分析，文章提出了冷藏豬肉中潛在生物標(biāo)志物變化的假設(shè)示意圖:與嘌呤和嘧啶代謝相關(guān)的二氫尿嘧啶和黃嘌呤含量隨著儲存時間的增加而上調(diào)，而谷氨酰胺和尿酸含量則下調(diào)。與酪氨酸代謝相關(guān)的代謝物變化是酪胺上調(diào)，也涉及通過苯丙氨酸代謝不斷產(chǎn)生苯y(tǒng)i醛（圖3）。

綜上，脂質(zhì)（甘油磷脂除外）、氨基酸、碳水化合物和核苷酸的降解和氧化是豬肉在儲存過程中產(chǎn)生非揮發(fā)性物質(zhì)的主要因素。嘌呤代謝、嘧啶代謝、戊糖代謝和蛋白質(zhì)降解是影響冷藏豬肉腐敗的主要代謝途徑。此外，脂肪酸可以通過TCA循環(huán)影響這一代謝過程中的物質(zhì)。表明可以利用在這些代謝途徑中檢測到的潛在生物標(biāo)志物來更好地了解儲存時間對冷藏豬肉質(zhì)量的影響（圖4）。

圖3 KEGG分析

圖4 豬肉樣品中特征非揮發(fā)性成分代謝途徑整合

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5. 新鮮度生物標(biāo)志物的鑒定

O2PLS用于檢查篩選的生物標(biāo)志物與冷藏豬肉質(zhì)量屬性之間的潛在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)D-木糖、2-酮-L-古洛糖酸、間氯馬尿酸、丙酮醛和丙酮酸與肉質(zhì)性狀（TVB-N、TVC和b*）呈正相關(guān)。在20種已鑒定的代謝產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)D-木糖、2-酮-D-葡萄糖酸、黃嘌呤、D-阿拉伯糖酸-1,4-內(nèi)酯?和丙酮醛與冷藏豬肉中的TVB-N和TVC值強相關(guān)（|r|>0.8），而其余代謝產(chǎn)物與一種或多種肉類性狀中等相關(guān)（|r |≤0.8）。為了確定可以用作冷藏豬肉新鮮度指標(biāo)的關(guān)鍵標(biāo)志化合物，基于與TVB-N和TVC值相關(guān)（|r|>0.8）的5個標(biāo)志化合物進(jìn)行了多元線性回歸分析，最終確定了3個關(guān)鍵標(biāo)志化合物：D-木糖、黃嘌呤和丙酮醛（圖5）。

圖5 O2PLS分析

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文章小結(jié)

文章建立了UHPLC-MS /MS代謝組學(xué)結(jié)合機器學(xué)習(xí)算法來分析冷藏豬肉中的非揮發(fā)性化合物。利用隨機森林模型篩選出40種潛在的生物標(biāo)志物，多元線性回歸分析表明D-木糖、黃嘌呤和丙酮醛可能是影響冷藏豬肉新鮮度的關(guān)鍵標(biāo)志化合物。

基于隨機森林機器學(xué)習(xí)算法的代謝組學(xué)策略總體工作流程
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【中科新生命】建立了完整的代謝組學(xué)服務(wù)平臺，其中非靶代謝組plus產(chǎn)品使用優(yōu)質(zhì)平臺和高質(zhì)海量自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫,采用嚴(yán)格的代謝物鑒定標(biāo)準(zhǔn)和要求，云平臺交互式分析，更有多篇頂刊項目文章（CELL等）加持，助您分析無憂。歡迎感興趣的老師前來咨詢。