? ? 目前，已批準(zhǔn)的胃腸道間質(zhì)瘤的治療方法都是酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼（Imatinib）、舒尼替尼（Sunitinib）、雷戈非尼（Regorafenib）主要用于KIT突變的GIST患者。近年來新獲批的阿伐普利尼用于治療PDGFRA 18號外顯子突變的GIST，利培替尼用于已經(jīng)接受前三種酪氨酸激酶抑制劑治療的晚期GIST患者。但酪氨酸激酶抑制劑治療，最終會導(dǎo)致KIT或PDGFRA繼發(fā)性耐藥突變，以致疾病繼續(xù)發(fā)生發(fā)展。

? ? 因此，研究者們想要找到晚期GIST的新型治療策略。轉(zhuǎn)錄因子在GIST的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，他們確定了一個新型且非酪氨酸激酶的靶標(biāo)GPR20（G蛋白偶聯(lián)受體20），這是一個有358個氨基酸的寡GPCR。GPR20的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子FOXF1和ETS變異轉(zhuǎn)錄因子1的調(diào)控。

? ??抗體藥物偶聯(lián)物（Antibody-Drug conjugates, ADC）是利用單克隆抗體的特異性，有選擇性地向抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞遞送強(qiáng)有力的細(xì)胞毒性藥物。它的作用原理如圖，ADC與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，內(nèi)部化并易位至溶酶體室，溶酶體內(nèi)的酶切作用使其釋放出所附載的細(xì)胞毒性藥物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。今天所介紹的ADC藥物，伊西替康衍生物，是一類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑，可使雙鏈DNA斷裂和細(xì)胞凋亡。連接抗體和藥物的linker，馬來酰亞胺GGFG四肽，可以被組織蛋白酶等，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的溶酶體酶切斷。這種linker-payload技術(shù)可以達(dá)到穩(wěn)定且較高的藥物抗體比率。

? ? 首先研究者需要制備用于GPR20的ADC藥物和免疫組化等使用的特異抗體。他們利用DNA免疫法得到了三個大鼠源的GPR20單抗，04-046、04-093、04-021，并通過實驗驗證了他們所結(jié)合的區(qū)域，04-046結(jié)合在胞外區(qū)1和胞外區(qū)2，04-093結(jié)合在胞外區(qū)1，04-021結(jié)合在N端結(jié)合域。使用Rat-ZAP來觀察抗體的內(nèi)部化活性，Rat-ZAP是一種偶聯(lián)了皂草素的二抗IgG，皂草素是一種核糖體失活蛋白，有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。04-046有很高的內(nèi)部化活性，可用作ADC藥物的抗體，但還需進(jìn)行人源化改造，降低免疫原性。另一個04-093適合用作IHC，后續(xù)改造成在實驗中效果更好的兔單抗，04-093OcH1L1。

? ? 研究團(tuán)隊在美國的Dana-Farber癌癥研究所(DFCI)收集了139個GIST樣本，其中GPR20陽性的占91%，通過切片的免疫組化鑒定并統(tǒng)計分析，制定了如下的GPR20和KIT表達(dá)分級標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在KIT等級越高時GPR20高表達(dá)的比率越高，說明GPR20和KIT的表達(dá)呈很強(qiáng)的正相關(guān)。然后統(tǒng)計不同組織內(nèi)的GIST樣本發(fā)現(xiàn)，在小腸和腹腔中GPR20高表達(dá)，其中腹腔是轉(zhuǎn)移病灶；按突變類型分類統(tǒng)計，KIT突變和KIT/PDGFRA WT GIST中GPR20表達(dá)量高，在PDGFRA突變的GIST中高等級GPR20表達(dá)為0，八例樣本中七例GPR20陽性的PDGFRA突變樣本都存在D842V點突變。接下來就KIT突變樣本組進(jìn)行細(xì)化的統(tǒng)計分析，KIT 外顯子13/14是ATP結(jié)合域，17/18是激酶活化環(huán)，他們常見于酪氨酸激酶抑制劑導(dǎo)致的耐藥突變，通過對比單個和兩個KIT突變，可以明顯觀察到KIT外顯子11+17突變比外顯子11突變樣本中有著更高比率的GPR20高表達(dá)。日本的東部癌癥中心(NCCHE)共收集100個樣本，與前統(tǒng)計分析有相似的結(jié)果，但外顯子9突變中GPR20的高表達(dá)沒有發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)計正常組織和不同腫瘤的樣本發(fā)現(xiàn)，GPR20只在GIST、ICC細(xì)胞和僅1例的平滑肌肉瘤中表達(dá)。在大于90%的系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥中都能觀察到KIT突變，但是沒有GPR20的表達(dá)，說明KIT激活和GPR20表達(dá)沒有明確的關(guān)聯(lián)性。

? ? DS-6157a的細(xì)胞生長抑制活性檢測，使用穩(wěn)轉(zhuǎn)GPR20表達(dá)載體的GIST-T1細(xì)胞系和NCI-N87胃癌細(xì)胞系對照，流式分析可見在穩(wěn)轉(zhuǎn)GPR20的GIST-T1細(xì)胞系中，GPR20高表達(dá)，NCI-N87沒有GPR20表達(dá)。DS-6157a所表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性由附載的藥物伊西替康衍生物提供，此抑制劑在兩種細(xì)胞系中都有很強(qiáng)的抑制活性，但DS-6157a只在GPR20高表達(dá)的細(xì)胞系中有抑制活性，IC50為156ng/mL，表現(xiàn)出其特異選擇性。

? ? DS-6157a的作用機(jī)制。研究者通過在DS-6157a上標(biāo)記pH敏感的染料，pHrodo，使用定時間隔成像分析，觀察ADC藥物的胞內(nèi)運(yùn)輸情況。WB結(jié)果表明DS-6157a與Dxd一樣，有著DNA損傷和細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)毒性。同時其有著抗體依賴的細(xì)胞毒性，沒有補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。

? ? 體內(nèi)實驗中，選擇GPR20陽性的CDX和PDX模型驗證DS-6157a的抗腫瘤活性。在GIST-T1/GPR20和GIST-T1的CDX模型中，靜脈注射給藥DS-6157a，表現(xiàn)出劑量依賴的腫瘤生長抑制，在3和10mg/kg劑量下可以觀察到腫瘤消退。對比給藥3mg/kg的兩組腫瘤大小，可看出GPR20高表達(dá)的CDX是更敏感的。腫瘤組織WB結(jié)果中可以觀察到給藥后引起的DNA損傷和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá)差異。GIST1和GIST6 PDX模型中，可在給藥10mg/kg劑量下觀察到明顯的腫瘤生長抑制。GIST6 PDX模型同時驗證了GPR20抗體和IgG-ADC對腫瘤生長都沒有影響。

? ? 接下來，研究者對比了DS-6157a和酪氨酸激酶抑制劑的抗腫瘤活性。GIST#1001 PDX中DS-6157a在5和10mg/kg劑量下阻斷腫瘤生長，與三個酪氨酸激酶抑制劑等效。GIST430/654是伊馬替尼耐藥的CDX模型，其含有伊馬替尼的常見耐藥突變，KIT外顯子13的V654A突變，DS-6157在其中表現(xiàn)出比舒尼替尼和雷戈非尼等效或更好的抗腫瘤活性。GIST#1338 PDX模型，取自處于雷戈非尼治療中的病人樣本，在此DS-6157a展現(xiàn)出比另三種酪氨酸激酶抑制劑更好的抗腫瘤活性。

? ? 最后，研究者在食蟹猴和大鼠上對DS-6157a的藥代動力學(xué)和安全性進(jìn)行了測試。通過單靜脈注射給藥0.1-30mg/kg，檢測其血藥濃度變化，食蟹猴上的藥代動力學(xué)檢測結(jié)果表明，DS-6157a和總抗體的血藥濃度情況幾乎無差別，說明DS-6157a的多肽linker在血漿中非常穩(wěn)定。安全性測試是在大鼠和食蟹猴上，利用間歇靜脈滴注的給藥方式，在各器官組織中檢測毒性物質(zhì)。結(jié)果表明在腸、腎等器官有極小或輕微的毒性成分。大鼠的STD10(10%動物嚴(yán)重毒性劑量)大于199mg/kg，其HED(人體等效劑量)為32mg/kg；食蟹猴的HNSTD(最高非嚴(yán)重毒性劑量)為30mg/kg，其HED為9.6mg/kg。這些非臨床的毒性研究表明DS-6157a的安全性，同時為人體臨床實驗確定了1.6mg/kg的起始劑量。

? ? 綜上，本文介紹了在胃腸道間質(zhì)瘤中大量表達(dá)，且有選擇性的新靶標(biāo)GPR20。靶向此蛋白的抗體藥物偶聯(lián)物，DS-6157a，在GIST異種移植瘤模型中表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性，其中包含有酪氨酸激酶抑制劑耐藥突變的腫瘤模型。食蟹猴和大鼠上的研究也表明他有很好的藥物-linker穩(wěn)定性和動物安全性。未來除繼續(xù)推進(jìn)臨床實驗外，還會深入分析研究罕見GIST亞群或有著RAS/Raf、PI3CA等基因突變的病例，進(jìn)一步明確GPR20表達(dá)水平影響療效的閾值。

參考文獻(xiàn)

1.?Kenji lida,?et al. Identification and Therapeutic Targeting of GPR20, Selectively Expressed in Gastrointestinal Stromal Tumors, with DS-6157a, a First-In-Class Antibody-Drug Conjugate. Cancer diScovery. 2021. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-1434.?

2. Parslow A, Parakh S, Lee F-T, Gan H, Scott A. Antibody–Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 2016;4:14.