前言

近日，歐易生物合作客戶復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院王群教授團隊在Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF:8.886）發(fā)表miR-6077通過CDKN1A/細胞周期阻滯和KEAP1/鐵死亡通路促進肺腺癌順鉑/培美曲塞耐藥相關(guān)研究結(jié)果，畢國澍、梁嘉琪、趙夢男為文章共同第一作者，歐易生物提供了該項目的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序工作，下面我們一起學習這篇文章的具體內(nèi)容。

材料： 4例術(shù)前CDDP/PEM治療病人LUAD組織，4例未治療病人LUAD組織

期刊： Molecular Therapy: Nucleic Acids

發(fā)表時間：2022年3月28日

運用歐易/鹿明技術(shù)：歐易生物10× Genomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究背景

肺腺癌 (LUAD) 是全球最常見的惡性腫瘤之一。順鉑（CDDP）+培美曲塞（PEM）聯(lián)合化療仍然是主要的治療方案，然而藥物抗性極大地限制了其治療潛力。本篇文章中作者通過CRISPR-Cas9篩選，將miR-6077確定為LUAD中CDDP/PEM抗性的關(guān)鍵驅(qū)動因素，在細胞系和患者來源的異位移植模型中，通過功能實驗證實， miR-6077的異位過表達使LUAD細胞對CDDP/PEM脫敏。通過對接受CDDP/PEM治療的患者樣本進行RNA測序和單細胞測序，發(fā)現(xiàn)CDDP/PEM誘導(dǎo)的CDKN1A和KEAP1上調(diào)，進而分別激活細胞周期停滯和鐵死亡，從而導(dǎo)致細胞死亡。

通過miRNA pull-down，確定并驗證了miR-6077靶向CDKN1A和 KEAP1。miR-6077可以通過CDKN1A-CDK1介導(dǎo)的細胞周期停滯和 KEAP1-NRF2-SLC7A11/NQO1介導(dǎo)的鐵死亡，保護LUAD細胞免受 CDDP/PEM 誘導(dǎo)的細胞死亡，從而在體外和體內(nèi)導(dǎo)致LUAD 細胞的耐藥。并且發(fā)現(xiàn)GMDS-AS1 和 LINC01128 通過吸附 miR-6077 使LUAD細胞對CDDP/PEM敏感。總的來說，這些結(jié)果表明miR-6077 在LUAD對CDDP/PEM敏感性中的關(guān)鍵作用，從而為臨床實踐中克服耐藥性提供了一種新的治療策略。

研究內(nèi)容解析

miR-6077的發(fā)現(xiàn)和功能驗證

（1）為了深入了解可能調(diào)節(jié)LUAD細胞對CDDP加PEM聯(lián)合化療敏感性的機制，作者首先進行了基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9功能篩選試驗，sgRNAs轉(zhuǎn)入到A549 細胞中用PBS或者CDDP/PEM處理7 或14天后進行轉(zhuǎn)錄組測序測量不同基因或 miRNA被敲除的細胞群的相對豐度，評估不同組別中sgRNA的表達。共篩選出11個能夠?qū)е翧549細胞對CDDP/PEM顯著敏感的miRNA，其中5個候選 miRNA具有單個剪接體并且以前沒有被報道過。其中miR-6077的過表達僅在CDDP/PEM存在的情況下導(dǎo)致細胞活力顯著增加，因此表明miR-6077可能作為LUAD對CDDP /PEM化療抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

（2）為了進一步確定miR-6077的臨床相關(guān)性，作者研究了其在腫瘤樣本中的表達，樣本為CDDP/PEM 抗性組 (n = 10) 和敏感組 (n = 10)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDDP/PEM 耐藥組的腫瘤中miR-6077水平顯著高于敏感組織，而在淋巴細胞或其他非腫瘤細胞中，miR-6077的水平遠低于腫瘤細胞中的水平，在測量 miR-6077在評估腫瘤對CDDP/PEM治療的反應(yīng)中的預(yù)測值時，發(fā)現(xiàn) miR-6077 水平的受試者ROC曲線下面積為 0.850，這些數(shù)據(jù)表明miR-6077與LUAD患者的 CDDP/PEM耐藥相關(guān)。

（3）為了進一步深入了解miR-6077在調(diào)節(jié) LUAD耐藥性中的作用機制，作者利用pull-down實驗和RNA-seq 來尋找A549 細胞系中與miR-6077結(jié)合的候選基因?；趤碜越Y(jié)構(gòu)和功能分析的證據(jù)，作者篩選了 CDKN1A和KEAP1以進行進一步的實驗驗證。miR-6077的過表達顯著抑制LUAD中CDKN1A和KEAP1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達。表明由CDDP/PEM處理引起的CDKN1A和KEAP1表達增強被miR-6077部分消除。進一步使用雙熒光素酶報告基因檢測證明CDKN1A和KEAP1是miR-6077的直接下游靶標。

圖1 | 全基因組CRISPR-Cas9篩選發(fā)現(xiàn)miR-6077 是LUAD 耐藥性的重要因素

miR-6077逆轉(zhuǎn)CDDP/PEM誘導(dǎo)的細胞周期停滯和鐵死亡

后續(xù)作者進一步研究了miR-6077通過靶向抑制CDKN1A和KEAP1導(dǎo)致CDDP/PEM抗性的下游細胞信號通路。針對CDDP/PEM處理或未處理的A549細胞的轉(zhuǎn)錄組測序差異基因富集分析顯示，在 CDDP/PEM處理后，一系列參與細胞周期和鐵死亡相關(guān)生物學途徑的基因，包括細胞周期G2/M轉(zhuǎn)變、脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激的反應(yīng)均顯著失調(diào)。為了消除來自位于腫瘤微環(huán)境中的其他非癌細胞的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，作者使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序來精確描述 CDDP/PEM治療誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄改變。經(jīng)過質(zhì)控后治療組共38599個細胞，未治療組共32372個細胞用于下游分析。降維聚類和marker基因分析識別腫瘤細胞（EPCAM 和SOX4）后進行兩組間GSEA分析，同樣發(fā)現(xiàn)細胞周期和鐵死亡相關(guān)通路，這些結(jié)果表明，這兩種途徑在LUAD細胞中被CDDP/PEM處理激活。

后續(xù)作者一方面對miR-6077進行異位表達，發(fā)現(xiàn)其能夠抵消CDDP/PEM處理后腫瘤細胞G2/M 停滯的異常細胞周期進展，這些結(jié)果暗示miR-6077保護CDDP/PEM處理的LUAD細胞免受細胞周期停滯，導(dǎo)致耐藥性和產(chǎn)生和細胞存活；另一方面針對鐵死亡途徑，作者首先驗證CDDP/PEM對腫瘤細胞增殖和活力的抑制作用是由鐵死亡引起，后續(xù)同樣通過miR-6077的外源過表達，表明miR-6077可以緩和腫瘤細胞的鐵死亡效應(yīng)?？傊?，這些結(jié)果表明，除了經(jīng)典的細胞死亡形式，如細胞凋亡和壞死外，CDDP/PEM可以通過鐵死亡誘導(dǎo)細胞毒性，而miR-6077部分消除了這種效應(yīng)并使 LUAD 細胞對CDDP/PEM治療脫敏。

圖2 | ?miR-6077保護LUAD細胞免受CDDP/PEM處理誘導(dǎo)的細胞周期停滯和鐵死亡

?miR-6077靶向CDKN1A抵消G2/M期阻滯并賦予腫瘤細胞CDDP/PEM 抗性

為了確定CDKN1A在miR-6077誘導(dǎo)的G2/M阻滯衰減和CDDP/PEM抗性中的介導(dǎo)作用，作者在LUAD細胞系中過表達或敲低CDKN1A，細胞毒性和克隆形成實驗表明，CDKN1A過表達抵消了miR-6077誘導(dǎo)的CDDP/PEM脫敏作用。具體機制方面，miR-6077對CDKN1A 的抑制作用導(dǎo)致CDK1及其活性形式p-CDK1-Thr161的上調(diào)，而這種作用通過CDKN1A恢復(fù)得以抵消，此外，當與PEM聯(lián)合使用時，CDKN1A的抵消作用也使細胞對卡鉑和奧沙利鉑敏感。總之，這些結(jié)果表明miR-6077以CDKN1A依賴的方式以及 CDKN1A的下游細胞周期調(diào)節(jié)使LUAD細胞對CDDP/PEM具有耐藥性。

?miR-6077靶向KEAP1，從而降低鐵死亡并賦予腫瘤細胞CDDP/PEM抗性

為了驗證miR-6077靶向KEAP1的效應(yīng)，作者在LUAD 細胞系中回復(fù)表達KEAP1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KEAP1上調(diào)可以消除miR-6077 的影響，導(dǎo)致在CDDP/PEM存在下抑制細胞活力和克隆形成能力，中和miR-6077對CDDP/PEM引起的鐵死亡的保護作用。此外，WB顯示miR-6077 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NRF2及其下游靶基因SLC7A11和NQO1的表達，這兩者都有助于抗鐵死亡，而這種效應(yīng)被回復(fù)KEAP1而消除，在LUAD細胞中過表達KEAP1也證實了上述結(jié)果?？偟膩碚f，這些研究結(jié)果表明，miR-6077通過抑制KEAP1賦予LUAD細胞CDDP/PEM抗性，從而保護細胞免受鐵死亡。

圖3 | 抑制miR-6077導(dǎo)致LUAD細胞對CDDP/PEM的化學敏感性

GMDS-AS1和LINC01128通過充當miR-6077的海綿使LUAD對CDDP/PEM敏感

進一步探索miR-6077的上游調(diào)控機制，作者通過結(jié)合miRNA pull-down實驗結(jié)果和在線工具預(yù)測了預(yù)測了5個可能與之結(jié)合的lncRNAs。通過細胞毒性試驗和qPCR初步評估候選分子在化學敏感性調(diào)節(jié)中的潛在功能，選擇GMDS-AS1和LINC01128進行后續(xù)實驗。一方面實驗驗證雙螢光素酶實驗驗證其與miR-6077結(jié)合，另一方面lncRNA pull-down和WB實驗表明lncRNA和Ago2參與miRNA介導(dǎo)的mRNA抑制，RIP實驗同樣證實了以上結(jié)果。這些結(jié)果表明GMDS-AS1和LINC01128與下游CDKN1A/KEAP1競爭含有 miR-6077的RISC，從而防止其mRNA降解。后續(xù)通過細胞內(nèi)的GMDS-AS1和LINC01128的過表達發(fā)現(xiàn)其可以抵消miR-6077的作用，上調(diào)CDKN1A和KEAP1，減少G2/M轉(zhuǎn)換和鐵死亡信號分子表達。這些結(jié)果表明 GMDS-AS1 和 LINC01128 通過靶向 miR-6077 作為調(diào)節(jié) CDKN1A 和 KEAP1 表達的競爭性內(nèi)源性 RNA 發(fā)揮作用，從而在 LUAD 細胞用 CDDP/PEM 處理時促進細胞周期停滯和鐵死亡。

miR-6077敲降和體外實驗證實miR-6077促進 LUAD細胞對CDDP/PEM的耐藥性

首先作者將miROFF-6077抑制劑轉(zhuǎn)染到H1299-CDDP/PEM 細胞進行miR-6077敲降，發(fā)現(xiàn)CDKN1A 和 KEAP1 的表達上調(diào)，單細胞數(shù)據(jù)也表明與未接受新輔助化療的細胞相比，來自CDDP/PEM治療組的細胞群的特征是CDKN1A和KEAP1的表達更高。另外，miR-6077 敲低可以降低 H1299-CDDP/PEM 的化學抗性，并加重化療誘導(dǎo)的細胞周期停滯和鐵死亡，這些結(jié)果與上述結(jié)果一致，證明 miR-6077 通過直接與CDKN1A 和 KEAP1結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞周期進程和鐵死亡，從而有助于 LUAD 對 CDDP/PEM 的抗性。

其次在小鼠體內(nèi)細胞系成瘤和PDX模型均證明在miR-6077注射后呈現(xiàn)一定的耐藥性，同樣證實miR-6077在LUAD細胞對CDDP/PEM的耐藥性中的重要作用。

研究結(jié)論

1. 表明 miR-6077 驅(qū)動腫瘤細胞對CDDP/PEM 的耐藥性，并且是接受聯(lián)合化療的LUAD患者的預(yù)后生物標志物；

2. 闡明CDKN1A 和KEAP1的特異性靶向是 miR-6077減輕腫瘤細胞在CDDP/PEM 處理后 G2/M期停滯和鐵死亡的分子機制；

3. GMDS-AS1和LINC01128 可以充當miRNA海綿發(fā)揮作用，從而在調(diào)節(jié) LUAD耐藥性方面產(chǎn)生與miR-6077相反的作用。

這些發(fā)現(xiàn)對我們理解LUAD的耐藥性具有重要意義，針對上述分子可能為對CDDP/PEM治療不敏感的LUAD提供新的治療策略。

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