前言

2022年5月，南京中醫(yī)藥大學霍介格、中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所陳兆國團隊（一作：蔡夢夢）聯(lián)合在Frontiers in Pharmacology期刊（IF：5.988）發(fā)表了題為“Disordered Gut Microbiota in Colorectal Tumor-Bearing Mice Altered Serum Metabolome Related to Fufangchangtai”的研究成果，通過血清代謝組的研究方法，探究了FFCT作用的機理，描繪了小鼠微生物菌群影響圖譜。為探討腸道微生物群（GM）與血清代謝的關系提供了理論依據(jù)。

中文標題：結直腸癌荷瘤小鼠腸道菌群紊亂與復方腸泰相關的血清代謝組改變

研究對象：結直腸癌荷瘤小鼠

發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology

影響因子：5.988

發(fā)表時間：2022年5月

運用組學技術：微生物16S rRNA測序、血清代謝組學

研究背景

結直腸癌（CRC）是一種影響結腸或直腸的癌癥。盡管由于人口篩查和內鏡監(jiān)測，CRC患者的死亡率正在穩(wěn)步下降，但就發(fā)病率和死亡率而言，CRC仍然是世界上第三高的。腸道微生物群（GM）一旦失去平衡，就會導致一些系統(tǒng)性疾病的發(fā)生。許多證據(jù)表明，CRC的發(fā)展與GM生態(tài)失調之間有很強的相關性，CRC治療的方法有很多，包括根治性手術、放療、化療、靶向治療、免疫治療等，但由于這些方法都有局限性，并會造成許多副作用。由于中藥的協(xié)同和衰減作用，在預防腫瘤復發(fā)和轉移方面起著不可或缺的作用。

根據(jù)臨床經驗，處方復方腸泰（FFCT）通過增強免疫系統(tǒng)、提高患者生活質量、減少副作用已被證明具有抗腫瘤作用。盡管GM可以與中藥成分進行復雜的互動，但是否會影響中藥對結直腸癌的療效仍然是未知的。因此，作者以FFCT作為中藥處方模型，探討了中藥治療中轉基因與中藥代謝的相關性。

研究思路

研究方法

1.實驗材料

人參、獼猴桃、紅芪、枳實、薏苡仁、苦參等六種中藥顆粒劑制備FFCT。

2.腸道微生物群檢測實驗

(1)實驗分組

PBS組：正常小鼠注射PBS并給予ddH2O

CT26組：CRC荷瘤小鼠給予ddH2O

CT26L組：CRC荷瘤小鼠服用0.65 mg/g FFCT

CT26M組：給予1.3 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠

CT26H組：給予2.6 mg/g FFCT的CRC腫瘤小鼠

(2)技術路線

給藥前，皮下接種CT26-LUC細胞到小鼠側翼（CRC荷瘤組），同時皮下接種PBS（PBS組）。PBS組和CT26組服用約ddH2O，其他組通過灌胃方式服用FFCT混懸液，并服用藥物4周。給藥27天后收集小鼠糞便樣本和分離血清樣本。

3.復方長泰血清代謝組學實驗

(1）實驗分組

對照組：正常小鼠注射PBS并給予ddH2O

CT26組：CRC荷瘤小鼠給予ddH2O

CT26H組：給予2.6 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠

CM組：給予PBS并給予2.6 mg/gFFCT的正常小鼠

(2)技術路線

給藥前，皮下接種CT26-LUC細胞，皮下接種于小鼠的側腹(CT26組和CT26H組)，同時皮下接種PBS(對照組和CM組)。CT26H組和CM組灌胃FFCT混懸液，給藥持續(xù)4周。從小鼠的眼球中抽取血液，收集上清液并儲存在干冰中用于血液質譜分析。

4.糞便微生物移植實驗

(1)實驗分組

將小鼠隨機分為兩組：FMT-CA-FFCT組（移植CRC患者糞便的小鼠）和FMT-H-FFCT組（移植健康對照組的糞便）。

(2)技術路線

在進行灌胃之前，所有小鼠均在水中用廣譜抗生素混合物2周。這兩組患者分別灌胃CRC患者或健康人的糞便懸浮液2周（每周兩次），同時灌胃FFCT（2.6 mg/g）2周。在最后一次口服給藥24小時后，從小鼠眼球中提取血樣，并儲存在?80°C，直到分析。

研究結論

1、復方腸泰調節(jié)CD4+和CD8+T細胞水平

FFCT治療對各組腫瘤體積無顯著影響（p>0.05），作者使用流式細胞儀分析了免疫細胞（CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞）的水平。結果表明，與CT26組相比，F(xiàn)FCT治療組脾臟和血液中的CD3+CD4+T細胞顯著增加，但兩組之間的腫瘤體積沒有顯著差異。與CT26組相比，CT26H組脾臟的CD3+CD8+T細胞增加，但兩組之間的血液和腫瘤沒有顯著差異。這些結果表明，F(xiàn)FCT可能通過提高血液和脾臟中CD3+CD8+和CD3+CD4+T細胞的水平來增強機體免疫力。

圖1 | CT26組和FFCT治療組的腫瘤體積和淋巴細胞百分比

2.復方腸泰對結直腸癌荷瘤小鼠腸道菌群的影響

使用微生物16s RNA基因測序分析不同組的腸道微生物組。分析結果表明，荷瘤小鼠與健康小鼠的GM存在顯著差異。對于CT26組和PBS組，兩組之間的腸道微生物群落聚集明顯不同（Adonis，p<0.05）。對于CT26組和PBS組，豐度等級曲線（補充圖S3B）表明，PBS組的群落相似性高于CT26組。圖2D中的數(shù)據(jù)顯示，兩組（CT26組和PBS組）的GM組成為要特征為厚壁菌、擬桿菌、變形桿菌、TM7和脫壁菌。兩組動物門的分布存在顯著差異。PBS組的厚壁菌和脫壁菌的豐度高于CT26組（p<0.05），而擬桿菌和放線菌的豐富度則較低（p<0.05）。如圖所示，兩個組的物種組成也有很大差異。

圖2 | CT26組和PBS組之間的GM差異

3.腫瘤引起的腸道微生物失調對復方腸泰代謝物的影響

對荷瘤小鼠（CT26H組）和健康小鼠（CM組）使用高劑量FFCT（2.6 mg/g），運用血清代謝組學比較兩組之間的血清代謝物。在CT26H組和CM組之間發(fā)現(xiàn)了243種不同的代謝物。富集前50種差異代謝物和KEGG途徑如圖3C、D所示。結合網絡檢索，苦參堿、異姜烯酮B和亮菌素主要與中醫(yī)有關，表明腫瘤的存在可能影響FFCT的代謝。數(shù)據(jù)表明，這些差異代謝物涉及多種途徑，包括氨酰tRNA生物合成、癌癥中的中樞碳代謝、脂肪細胞中脂解的調節(jié)、鞘脂信號途徑、花生四烯酸代謝、癌癥中膽堿代謝和鐵沉降等。

圖3 | CT26H和CM組的血清代謝組學研究

4.結直腸癌患者腸道菌群失調對復方腸泰代謝產物的影響

結直腸癌荷瘤小鼠的GM紊亂改變了與FFCT相關的血清代謝組。然而，在血清代謝組變化中起關鍵作用的腸道微生物群或腫瘤尚不清楚。FMT-CA組和FMT-H小鼠使用高劑量的FFCT（2.6 mg/g）比較兩組之間的血清代謝，不包括腫瘤因素。PCA圖和代謝物強度分布框表明樣品相對穩(wěn)定。如OPLS-DA圖所示，兩組的樣本被清楚地分離，表明兩組之間存在一定差異。FMT-H-FFCT組的血清代謝物包括尿酸、茉莉酸、間香豆素酸、膽酸、熊果酸、鵝去氧膽酸、γ-谷氨酰酪氨酸和一些氨基酸高于FMT-CA-FFCT組。結合網絡檢索，茉莉酸和間香豆酸與中醫(yī)藥有關，表明腸道微生物群可以作為單一因素影響FFCT的代謝。

圖4 | FMT小鼠血清代謝的質譜

（A） FMT-CA-FFCT和FMT-H-FFCT組的OPLS-DA評分圖；

（B） FMT-CA-FFCT組和FMT-H-FFCT組前50種不同代謝物的熱圖（p<0.05）；

5.復方腸泰對荷瘤小鼠腸道微生物的改善作用

荷瘤組和健康組的GM和FFCT的血清代謝有很大差異。GM在荷瘤小鼠體內的失調與FFCT相關的血清代謝物較少相對應。微生物16S rRNA基因測序用于檢測不同劑量的FFCT對荷瘤小鼠GM的影響，發(fā)現(xiàn)FFCT治療組（CT26L、CT26M、CT26H）的GM組成不同。FFCT治療組的腸道微生物群落差異性高于CT26組。FFCT治療組的厚壁菌豐度高于腫瘤組，這與健康組的趨勢相似。此外，隨著FFCT濃度的增加，厚壁菌的豐度降低。相反，F(xiàn)FCT治療組的擬桿菌豐度低于腫瘤組，這也顯示出與PBS組相似的趨勢。CT26M組的擬細菌豐度最低，變形桿菌和放線桿菌豐度最高。

圖5 | CT26組和FFCT治療組之間的GM差異

研究結論

本文通過腸道微生物群檢測實驗、復方腸泰血清代謝組學實驗、糞便微生物群移植實驗三個實驗以及流式細胞術分析、血清代謝組學分析、腸道微生物群分析、統(tǒng)計分析四個分析發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠GM的生態(tài)失調降低了與FFCT相關的血清代謝產物，F(xiàn)FCT可以糾正結直腸荷瘤小鼠GM的紊亂，發(fā)揮作用。CRC負荷下的轉基因生態(tài)失調阻斷了FFCT的吸收和代謝，說明更健康的腸道微環(huán)境有利于FFCT更好的療效。此外，F(xiàn)FCT還可以糾正CRC個體GM的失衡。本研究通過結合腸道微生物群和血清代謝為FFCT的治療效果提供了新的視角，為改善CRC患者的GM狀態(tài)提供了基礎，以獲得更好的療效。

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這篇文章以全新的角度闡述了腸道微生物群（GM）與血清代謝的關系，實驗以抗腫瘤泰（FFCT）作為結直腸癌（CRC）治療模型，以FFCT作為中藥處方模型，主要通過腸道微生物群檢測實驗、復方腸泰血清代謝組學實驗、糞便微生物群移植實驗三個實驗以及流式細胞術分析、血清代謝組學分析、腸道微生物群分析、統(tǒng)計分析四個分析清晰明了地分析了實驗探究的過程，從而發(fā)現(xiàn)了復方腸泰可以改善荷瘤小鼠的腸道微生物群。

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