上期文章主要介紹了線粒體自噬的主要過程和分類，本期將對線粒體自噬作用機(jī)制做詳細(xì)介紹。線粒體自噬主要依賴兩種通路：泛素依賴通路和非泛素依賴通路，示意圖見圖1。

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圖1 線粒體作用機(jī)制[1]

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泛素化依賴通路

泛素化依賴通路即依賴于線粒體表面蛋白的泛素化來促進(jìn)線粒體自噬，PINK1/Parkin通路是目前研究最深入的泛素化依賴通路。PINK1是一種高度保守的線粒體蛋白，參與線粒體功能的調(diào)節(jié)。Parkin是一種E3泛素連接酶，負(fù)責(zé)連接Ub分子和底物蛋白，帶有Ub標(biāo)簽的底物蛋白會被蛋白酶識別并降解。

正常線粒體中，PINK1會在線粒體靶向序列的引導(dǎo)下進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，隨后被位于線粒體基質(zhì)和內(nèi)膜上的蛋白酶（MPP、PARL）切割，再被釋放到胞質(zhì)中被泛素-蛋白酶體水解。而在受損線粒體中，線粒體去極化，膜電位降低，PINK1聚集在線粒體膜表面，通過Parkin及其底物Ub在Ser65位點的磷酸化（pSer65-Ub）激活Parkin E3泛素連接酶活性[2]。pSer65-Ub在線粒體外膜上積累可觸發(fā)自噬受體OPTN和NDP52對自噬起始因子（如ULK1、DFCP1等）的募集，促進(jìn)線粒體自噬。另外，有研究發(fā)現(xiàn)p62（自噬相關(guān)連接蛋白）在線粒體自噬中也發(fā)揮了重要作用，敲低p62不影響Parkin的募集，但會影響受損線粒體的清除[3]。除了激活Parkin招募自噬受體外，PINK1還可以通過泛素磷酸化直接募集OPTN和NDP52促進(jìn)線粒體自噬[4-5]。

非泛素化依賴通路

這一種通路主要由自噬受體介導(dǎo)，它們不經(jīng)泛素化直接與LC3結(jié)合，從而啟動線粒體自噬。在哺乳動物中，這些受體位于線粒體外膜，主要包括NIX（也稱為BNIP3L）、BNIP3、FUNDC1蛋白（見圖1）。

NIX蛋白可通過其BH3結(jié)構(gòu)域直接與LC3結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體自噬。BNIP3與NIX同屬于抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族的亞家族，包含BH3結(jié)構(gòu)域，因此同樣可直接與LC3結(jié)合。小鼠神經(jīng)元細(xì)胞敲除BNIP后，研究人員發(fā)現(xiàn)NIX表達(dá)上調(diào)，但線粒體自噬水平仍明顯降低，NIX上調(diào)并不能彌補(bǔ)BNIP缺失的后果[6]。

FUNDC1可通過與LC3相互作用誘導(dǎo)低氧下哺乳動物細(xì)胞的Parkin非依賴性線粒體自噬。雖然FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬不依賴于Parkin，但另一種線粒體E3泛素連接酶MARCH5可通過泛素化降解FUNDC1來調(diào)節(jié)缺氧條件下的線粒體自噬[7]。此外，F(xiàn)UNDC1誘導(dǎo)的線粒體自噬還受磷酸化的調(diào)控。有研究報道在心肌缺血/再灌注損傷模型中，F(xiàn)UNDC1去磷酸化激活線粒體自噬，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（RIPK3）可抑制FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，證明磷酸化參與調(diào)控FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬[8]。

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有效清除受損或冗余的線粒體也是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，為助力線粒體自噬的研究，漢恒生物研發(fā)了多種線粒體自噬工具（詳見表1）。

?表1 漢恒生物線粒體自噬研究工具

EGFP-LC3單標(biāo)記的熒光探針可以監(jiān)測 LC3 蛋白參與自噬起始過程，Mito-dsred線粒體特異性定位熒光探針可定位線粒體，兩者共轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可準(zhǔn)確實時地追蹤線粒體自噬的動態(tài)過程。自噬通路單標(biāo)研究工具Parkin-EGFP、Bnip3-EGFP、Nix-EGFP、FUNDC1-EGFP，與Mito-dsred線粒體共感染目的細(xì)胞可鑒別相關(guān)信號分子的線粒體轉(zhuǎn)位。mt-Keima、Cox8a-EGFP-mcherry可獨立應(yīng)用于線粒體自噬的研究。

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參考文獻(xiàn)

[1]Lu, Yingying., Li, Zhijia., Zhang, Shuangqian., Zhang, Tongtong., Zhang, Tongtong.. Cellular mitophagy: Mechanism, roles in diseases and small molecule pharmacological regulation. Theranostics, 2023, .

[2]Riley, B E., Lougheed, J C., Callaway, K., Velasquez, M., Brecht, E.. Structure and function of Parkin E3 ubiquitin ligase reveals aspects of RING and HECT ligases. Nature communications, 2013, 4.

[3]Geisler, Sven., Holmstr?m, Kira M., Skujat, Diana., Fiesel, Fabienne C., Rothfuss, Oliver C.. ?PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature cell biology, 2010, 12(2):119-31.

[4]Lazarou, Michael., Sliter, Danielle A., Kane, Lesley A., Sarraf, Shireen A., Wang, Chunxin.. ?The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature, 2015, 524(7565):309-314.

[5]Richter, Benjamin., Sliter, Danielle A., Herhaus, Lina., Stolz, Alexandra., Wang, Chunxin.. ?Phosphorylation of OPTN by TBK1 enhances its binding to Ub chains and promotes selective autophagy of damaged mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(15):4039-44.

[6]Shi, Ruo-Yang., Zhu, Sheng-Hua., Li, Victor., Gibson, Spencer B., Xu, Xing-Shun.. BNIP3 interacting with LC3 triggers excessive mitophagy in delayed neuronal death in stroke. CNS neuroscience & therapeutics, 2014, 20(12):1045-55.

[7]Chen, Ziheng., Chen, Ziheng., Liu, Lei., Cheng, Qi., Cheng, Qi.. Mitochondrial E3 ligase MARCH5 regulates FUNDC1 to fine-tune hypoxic mitophagy. EMBO reports, 2017, 18(3):495-509.

[8]Zhou, Hao., Zhu, Pingjun., Guo, Jun., Hu, Nan., Wang, Shuyi.. Ripk3 induces mitochondrial apoptosis via inhibition of FUNDC1 mitophagy in cardiac IR injury. Redox biology, 2017, 13:498-507.