來自美國(guó)加州理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種高度靈敏的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)——超靈敏序貫熒光原位雜交（ultrasensitive，sequential fuorescence?in situ?hybridization，USeqFISH），可實(shí)現(xiàn)完整組織中內(nèi)源性和病毒RNA的空間轉(zhuǎn)錄組分析。利用USeqFISH，研究人員揭示了腺相關(guān)病毒（adeno-associated viruses，AAVs）載體突變體在小鼠大腦區(qū)域中的不同細(xì)胞亞型偏差，包括AAV-PHP.N對(duì)興奮性神經(jīng)元的偏差，也展示了USeqFISH在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中原位AAVs分析和多模態(tài)單細(xì)胞分析的潛在應(yīng)用。該文章發(fā)表于2023年1月Nature Biotechnology上，以下是文章的詳細(xì)解讀。

文章題目：Spatial Transcriptomics for Profiling the Tropism of Viral Vectors in Tissues

發(fā)表時(shí)間：2023-01-26

發(fā)表期刊：Nature Biotechnology

主要研究團(tuán)隊(duì)：美國(guó)加州理工學(xué)院等

影響因子：68.164

DOI：10.1038/s41587-022-01648-w

腺相關(guān)病毒是體內(nèi)基因傳遞的高效特異性載體。天然AAVs由于其致病性極小、長(zhǎng)期持久性和具有不同感染性的血清型而被廣泛應(yīng)用于研究和臨床領(lǐng)域。通過合理設(shè)計(jì)和/或定向進(jìn)化對(duì)AAVs衣殼進(jìn)行工程改造后，可用于有效地將靜脈基因轉(zhuǎn)移到中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，或優(yōu)先轉(zhuǎn)移到嚙齒動(dòng)物的某些細(xì)胞類型。

最近開發(fā)的用于非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物（non-human primate，NHP）大腦或肌肉的高效、微創(chuàng)基因訪問的AAVs載體顯示了工程AAV載體對(duì)靶向基因傳遞的適用性及臨床轉(zhuǎn)化的前景。為了實(shí)現(xiàn)完整組織中AAVs的高通量、高分辨率分析，來自美國(guó)加州理工學(xué)院的研究人員通過整合基于水凝膠的組織清除、增強(qiáng)的信號(hào)放大和使用序貫標(biāo)記的多路復(fù)用，開發(fā)了一種高度敏感的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)USeqFISH，可提供與受感染宿主的內(nèi)源性基因相關(guān)的混合AAVs的詳細(xì)轉(zhuǎn)導(dǎo)和趨向性情況。

01：USeqFISH的工作原理及性能評(píng)估

USeqFISH包括RCA（rolling-circle amplification）和HCR（hybridization chain?reaction）組合（RCAHCR）的信號(hào)放大策略，以及通過立足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換的兩步hairpin和啟動(dòng)子剝離方法的序貫標(biāo)記策略（用于序貫標(biāo)記的兩步剝離）。RCAHCR是通過將探針與靶基因雜交，利用RCA生成DNA擴(kuò)增子，將啟動(dòng)子與擴(kuò)增子雜交，最后通過添加hairpins觸發(fā)自發(fā)的HCR組裝來進(jìn)行的，而具有立足點(diǎn)序列（10 nt）的hairpin可通過鏈置換介導(dǎo)自發(fā)分解。研究人員通過性能評(píng)估發(fā)現(xiàn)，USeqFISH可以檢測(cè)完整生物組織中的約50種RNA（4種顏色×13輪），通過靶向≤160 nt的序列而沒有實(shí)質(zhì)性損失（與HCR或scRNA-seq相比），且具有更明亮的信號(hào)。

02：USeqFISH的適用性分析

研究人員針對(duì)USeqFISH是否可以檢測(cè)從轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中的病毒基因組轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)USeqFISH可以在體外選擇性檢測(cè)病毒基因組中短至14 nt的突變區(qū)域。此外，研究人員以每只動(dòng)物1×1011個(gè)載體基因組（vector genomes，vg）的劑量，通過靜脈向成年小鼠注射病毒并在注射后3周收獲大腦，結(jié)果顯示，使用帶有針對(duì)條形碼的探針的USeqFISH能夠標(biāo)記來自不同腦區(qū)的表達(dá)mNG（mNeonGreen）的細(xì)胞中病毒基因組的RNA轉(zhuǎn)錄本，支持USeqFISH通過讀取唯一分配給每個(gè)病毒基因組的條形碼來并行檢測(cè)組織中多個(gè)系統(tǒng)遞送的AAVs的適用性。

為了將USeqFISH應(yīng)用于池系統(tǒng)（pooled systemic） AAVs的原位分析，研究人員進(jìn)一步設(shè)計(jì)了病毒貨物（cargo），包括非熒光的短編碼序列和縮短的WPRE、W3SL，使其基本組件盡可能緊湊，以便為要測(cè)試的序列留出空間。結(jié)果顯示，被包裝在池系統(tǒng)AAVs中的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率取決于注射劑量，并強(qiáng)調(diào)了在實(shí)驗(yàn)批次之間使用匹配劑量以準(zhǔn)確驗(yàn)證和表征AAV衣殼的重要性。此外，即使在最小劑量107?vg下，USeqFISH也可以檢測(cè)AAV轉(zhuǎn)錄本，但對(duì)于定量分析，每個(gè)突變體需要≥1010?vg的劑量。

為了證明USeqFISH對(duì)AAVs進(jìn)行高通量、高分辨率分析的能力，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)包含6個(gè)系統(tǒng)AAVs的池（pool；圖2）。這個(gè)池包括先前確定的AAV-PHP.eB6、AAV.CAP-B10、AAV-PHP.N7、AAV-PHP.V1、 AAV-PHP.B8，以及一種新的突變體AAV-PHP.AX。通過USeqFISH分析，描述了每個(gè)突變體的已知特征，如總體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和主要細(xì)胞類型趨向性，并揭示了每個(gè)突變體在跨多個(gè)大腦區(qū)域（皮質(zhì)、紋狀體、丘腦和小腦）的相對(duì)不同的細(xì)胞亞型趨向性。值得注意的是，AAV-PHP.AX能有效且廣泛地轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元亞型和星形膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)與基因調(diào)控元件配對(duì)時(shí)，其具有更高的靈活性來調(diào)節(jié)趨向性。

除了AAVs衣殼分析外，研究人員通過設(shè)計(jì)一個(gè)由13種突變體組成的池，該池包含AAV基因組3 ' UTR中的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的microRNA靶位點(diǎn)（microRNA target sites，miRNA TSs；microRNA的互補(bǔ)序列），具有獨(dú)特的條形碼（12種具有獨(dú)特miRNA TS的突變體，1種不具有miRNA TS的對(duì)照），檢查了USeqFISH在原位表征AAVs系統(tǒng)的匯集調(diào)控貨物方面的能力，證實(shí)了USeqFISH是一種適用于研究工程貨物對(duì)組織中AAVs系統(tǒng)調(diào)控作用的有效方法。

03：USeqFISH在NHP大腦中的應(yīng)用

為了成功地將工程AAVs轉(zhuǎn)化為基因治療工具，研究人員通過擴(kuò)展探針設(shè)計(jì)流程納入了狨猴（Callithrix jacchus）和恒河猴 （Macaca mulatta）兩個(gè)代表性的NHP物種，并驗(yàn)證了USeqFISH檢測(cè)內(nèi)源性mRNA（如主要抑制亞型：Pvalb、Sst和Vip）和完整腦組織中表達(dá)的病毒轉(zhuǎn)錄本的能力（圖3）。此外，研究人員通過探索USeqFISH和病毒工具組合在NHP大腦多模態(tài)原位單細(xì)胞分析中的潛在應(yīng)用，證明了USeqFISH的多功能性及其與其他單細(xì)胞標(biāo)記和條形碼方法的兼容性，并表明USeqFISH與病毒工具相結(jié)合可用于研究跨物種組織的細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)。

推進(jìn)工程化AAVs以精確獲取細(xì)胞亞型的一個(gè)挑戰(zhàn)是缺乏高通量、高分辨率的分析來表征體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。而本研究開發(fā)的USeqFISH能夠提供與受感染宿主的內(nèi)源基因相關(guān)的混合AAVs的詳細(xì)轉(zhuǎn)導(dǎo)和趨向性情況。USeqFISH具有以下三個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）適用于分析細(xì)胞培養(yǎng)物中的內(nèi)源性和外源性引入基因，以及小鼠和NHP的完整組織；（2）在開始時(shí)完成所有基因的限速和高溫步驟（探針雜交和涉及酶的RCA），隨后在室溫下進(jìn)行多輪HCR，與其他序貫標(biāo)記方法相比，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和儀器安裝；（3）能提供異常明亮和靈敏的RNA信號(hào)可視化，只有一個(gè)短的獨(dú)特序列（14 nt用于培養(yǎng)的細(xì)胞，40 nt用于組織）。

此外，USeqFISH還可以實(shí)現(xiàn)稀有和短的非編碼RNA的空間單細(xì)胞分析。通過USeqFISH分析，研究人員揭示了池中每個(gè)突變體的顯著特征，例如，它們?cè)诓煌?xì)胞類型中的富集，以及通過相互比較突變體同時(shí)最小化動(dòng)物間變異性揭示的潛在趨向性偏差。USeqFISH可以連接空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和AAV工程，有助于推進(jìn)用于靶向基因傳遞的病毒工具及其在基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究中的更廣泛應(yīng)用。