研究背景

? ? ? 結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）在全球范圍內(nèi)是發(fā)病率第三、致死率第四的高發(fā)癌癥。CRC包含腺癌、類癌、肉瘤和淋巴瘤等，最為常見的是腺癌，占比高達(dá)95%。這篇多組學(xué)文獻(xiàn)是湯富酬教授和付衛(wèi)教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合發(fā)表于《GUT》，家族性腺瘤性息肉?。‵amilial Adenomatous Polyposis, FAP）是CRC的一種特殊病例，是由APC抑癌基因胚系突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳的結(jié)直腸腺瘤綜合征，同一個(gè)FAP患者可能同時(shí)取得低級別腺瘤、高級別腺瘤以及腺癌組織，避免了癌癥機(jī)理研究中不同患者之間腫瘤組織的個(gè)體差異巨大的問題，為研究腺瘤向腺癌轉(zhuǎn)化的過程提供了天然的研究模型。

研究思路

? ? ??選取6例典型FAP患者、1例非典型FAP患者（MUTYH突變相關(guān)的結(jié)直腸多發(fā)腺瘤）通過全基因組淺測序和全外顯子組深測序，深入的研究了來自于同一個(gè)FAP患者的多個(gè)病變組織之間的譜系發(fā)生關(guān)系以及良性腺瘤向惡性腺癌轉(zhuǎn)變過程中的基因組變異情況。同時(shí)，為了研究腺瘤發(fā)生及腺瘤向腺癌惡變過程中的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化，對6例典型FAP患者、1例非典型FAP患者以及2例對照散發(fā)結(jié)直腸癌患者的8757個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。并以這些單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，重構(gòu)了腺瘤發(fā)生以及腺瘤向腺癌惡化的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化過程，系統(tǒng)的闡述了該過程中重要的基因表達(dá)變化事件。

研究結(jié)果

? ? ??首先在基因組水平上（全基因組重測序和全外測序）比較來自于同一個(gè)患者的不同病變階段的腺瘤和腺癌組織，發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，即使是低級別腺瘤的體細(xì)胞突變數(shù)目已經(jīng)明顯增多。良性的高級別腺瘤的體細(xì)胞突變數(shù)目甚至可以比惡性腺癌的體細(xì)胞突變數(shù)目還高。出現(xiàn)頻率最高的潛在體細(xì)胞致病突變是抑癌基因APC基因。不同患者在其他潛在的致病基因的突變譜上表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的個(gè)體間異質(zhì)性。與以前的報(bào)道一致，APC是人結(jié)腸直腸上皮細(xì)胞中的gatekeeper基因，APC具有最高的突變頻率，包括體細(xì)胞突變，拷貝中性雜合性缺失和拷貝數(shù)變異。

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? ? ??同一FAP患者同時(shí)取到了低級別腺瘤、高級別腺瘤以及惡變的腺癌組織樣本，這一優(yōu)勢非常適合于腫瘤克隆演化研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病變始祖細(xì)胞分裂增殖后遷移到腸上皮組織的不同部位并進(jìn)一步發(fā)展為腺瘤和腺癌。

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（A）熱圖顯示來自FAP1的所有樣品中體細(xì)胞突變的區(qū)域分布。

（B）通過使用最大簡約算法，從FAP1到不同病變階段的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

（C）同一細(xì)胞來源的示意圖，表明FAP1的所有病灶樣本均來自同一病變細(xì)胞。

（D）在由體細(xì)胞突變構(gòu)建的FAP1的系統(tǒng)樹上呈現(xiàn)了克隆或單個(gè)CNA和cnLOH。

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? ? ??FAP上皮細(xì)胞中最顯著上調(diào)的基因是OLFM4，該基因被認(rèn)為腸干細(xì)胞和CRC細(xì)胞亞群的標(biāo)記物。另一個(gè)上調(diào)基因ATF3是一種致癌的抑制轉(zhuǎn)錄因子，可由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生。對FAP上調(diào)基因的GO分析顯示，上調(diào)基因在代謝過程中有很強(qiáng)的富集，包括肽生物合成、核苷酸代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝過程。MKI67免疫組化染色證實(shí)FAP患者正常上皮細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。

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（A）熱圖顯示FAP患者相鄰正常組織的上皮細(xì)胞（30個(gè)差異基因）與散發(fā)性CRC患者相鄰正常組織的上皮細(xì)胞（15個(gè)基因）之間的差異。

（B）與CRC正常結(jié)腸上皮相比，在FAP結(jié)腸上皮中顯示更高表達(dá)水平的基因的基因本體分析。

（C）FAP2鄰近正常組織和CRC患者（非FAP）鄰近正常組織中MKI67的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。

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? ? ??前述證據(jù)已說明來自同一病例的所有腺瘤腺癌樣本均來自同一細(xì)胞，那么這些樣本的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性情況如何呢。研究人員通過tSNE分析，將來自FAP1的所有上皮細(xì)胞分為四個(gè)簇。簇1和簇2主要由來自腺瘤1的三個(gè)區(qū)域（Ade1R1，Ade1R2和Ade1R3）和癌的第二區(qū)域（CarR2）的細(xì)胞組成。第三個(gè)簇主要由腺瘤3（Ade3）和癌的第三區(qū)域（Car region3）的細(xì)胞組成。簇4主要由癌的第一和第四區(qū)域（CarR1和CarR4）的細(xì)胞組成。ANG，ANPEP和FGL1在簇2。與來自其他簇的細(xì)胞相比，簇4的細(xì)胞顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征。在簇4中特異性表達(dá)的基因在WNT信號傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、上皮層的形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞連接富集。

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? ? ??利用來自FAP患者癌旁組織、低級別腺瘤、高級別腺瘤、以及腺癌的上皮細(xì)胞之間的系統(tǒng)比較探究了腺瘤發(fā)生以及腺瘤向腺癌轉(zhuǎn)變過程中轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化。擬時(shí)序分析結(jié)果顯示將隨腫瘤發(fā)展呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的基因按照其變化趨勢分為了4類。三羧酸循環(huán)相關(guān)的代謝基表達(dá)因在良性腺瘤發(fā)生的早期就開始明顯下調(diào)，反而在從良性腺瘤到惡性腺癌的轉(zhuǎn)變過程中有所回升，但仍然低于癌旁組織中正常上皮細(xì)胞中的水平。這說明三羧酸循環(huán)代謝水平的降低是腫瘤發(fā)生過程中的最早期事件之一，可能是治療FAP患者的較好的治療靶點(diǎn)通路。

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? ? ??這項(xiàng)研究實(shí)屬基因組和轉(zhuǎn)錄組兩大層次的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，利用全基因組重測序和全外測序組合揭示出FAP基因組變異圖譜，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序構(gòu)建了首張F(tuán)AP轉(zhuǎn)錄組圖譜。全基因組重測序和全外測序的組合可以得到更加全面的更加全面的SNV/InDel/CNV變異信息，全基因組重測序覆蓋全面均一，CNV檢測準(zhǔn)確；全外測序針對外顯子區(qū)設(shè)計(jì)，在相同的通量下測序深度高，有利于SNV、InDel的檢測。?